I metaboliti immunomodulatori sò una caratteristica chjave di u microambiente tumorale (TME), ma cù poche eccezioni, e so identità restanu in gran parte scunnisciute. Quì, avemu analizatu i tumori è e cellule T da i tumori è l'ascite di i pazienti cun carcinoma sierosu di altu gradu (HGSC) per rivelà u metaboloma di questi diversi compartimenti TME. L'ascite è e cellule tumorali anu ampie differenze di metaboliti. In paragone cù l'ascite, e cellule T chì infiltranu u tumore sò significativamente arricchite in 1-metilnicotinamide (MNA). Ancu s'è u livellu di MNA in e cellule T hè elevatu, l'espressione di a nicotinamide N-metiltransferasi (un enzima chì catalizeghja u trasferimentu di gruppi metilici da S-adenosilmetionina à nicotinamide) hè limitata à i fibroblasti è e cellule tumorali. Funzionalmente, u MNA induce e cellule T à secretà a citochina chì prumove u tumore, u fattore di necrosi tumorale alfa. Dunque, u MNA derivatu da u TME cuntribuisce à a regulazione immune di e cellule T è rapprisenta un potenziale bersagliu di immunoterapia per u trattamentu di u cancru umanu.
I metaboliti derivati ​​da u tumore ponu avè un prufondu effettu inhibitoriu nantu à l'immunità antitumorale, è sempre più evidenze mostranu chì ponu ancu serve cum'è una forza motrice chjave per a progressione di a malattia (1). In più di l'effettu Warburg, u travagliu recente hà cuminciatu à caratterizà u statu metabolicu di e cellule tumorali è a so relazione cù u statu immunitariu di u microambiente tumorale (TME). Studi nantu à i mudelli di topi è e cellule T umane anu dimustratu chì u metabolismu di a glutammina (2), u metabolismu ossidativu (3) è u metabolismu di u glucosiu (4) ponu agisce indipindentamente nantu à vari sottogruppi di cellule immunitarie. Parechji metaboliti in queste vie inibiscenu a funzione antitumorale di e cellule T. Hè statu pruvatu chì u bloccu di a coenzima tetraidrobiopterina (BH4) pò dannà a proliferazione di e cellule T, è l'aumentu di BH4 in u corpu pò aumentà a risposta immunitaria antitumorale mediata da CD4 è CD8. Inoltre, l'effettu immunosoppressivu di a kynurenina pò esse salvatu da l'amministrazione di BH4 (5). In u glioblastoma mutante di l'isocitrato deidrogenasi (IDH), a secrezione di (R)-2-idrossiglutarato (R-2-HG) enantiometabolicu inibisce l'attivazione, a proliferazione è l'attività di citolisi di e cellule T (6). Recentemente, hè statu dimustratu chì u metilgliossale, un sottoprodotto di a glicolisi, hè pruduttu da cellule soppressorie d'origine mieloide, è u trasferimentu di metilgliossale da e cellule T pò inibisce a funzione di e cellule T effettrici. In u trattamentu, a neutralizazione di u metilgliossale pò superà l'attività di e cellule soppressorie derivate da mieloidi (MDSC) è migliurà sinergisticamente a terapia di bloccu di i checkpoint in i mudelli murini (7). Quessi studii mettenu in risaltu cullettivamente u rolu chjave di i metaboliti derivati ​​da TME in a regulazione di a funzione è di l'attività di e cellule T.
A disfunzione di e cellule T hè stata largamente signalata in u cancru di l'ovaru (8). Questu hè in parte duvutu à e caratteristiche metaboliche inerenti à l'ipossia è à a vasculatura tumorale anormale (9), chì risulta in a cunversione di glucosiu è triptofanu in sottoprodotti cum'è l'acidu latticu è a kynurenina. L'eccessu di lattatu extracellulare riduce a produzzione di interferone-γ (IFN-γ) è porta à a differenziazione di sottogruppi mielosoppressivi (10, 11). U cunsumu di triptofanu inibisce direttamente a proliferazione di e cellule T è inibisce a segnalazione di i recettori di e cellule T (12-14). Malgradu queste osservazioni, assai travagli intornu à u metabolismu immune sò stati realizati in cultura di cellule T in vitro utilizendu terreni ottimizzati, o limitati à mudelli di topi omologhi in vivo, nimu di i quali riflette cumpletamente l'eterogeneità di i cancri umani è di u macro è microambiente fisiologicu.
Una caratteristica cumuna di u cancru di l'ovaru hè a diffusione peritoneale è l'apparizione di ascite. L'accumulazione di fluidu cellulare in l'ascite hè assuciata à una malattia avanzata è à una prognosi sfavurevule (15). Sicondu i rapporti, questu compartimentu unicu hè ipossicu, hà alti livelli di fattore di crescita endoteliale vasculare (VEGF) è indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO), è hè infiltratu da cellule T regulatorie è cellule inibitorie mieloidi (15-18). L'ambiente metabolicu di l'ascite pò esse diversu da quellu di u tumore stessu, dunque a riprogrammazione di e cellule T in u spaziu peritoneale ùn hè chjara. Inoltre, e differenze chjave è l'eterogeneità trà l'ascite è i metaboliti presenti in l'ambiente tumorale ponu impedisce l'infiltrazione di e cellule immunitarie è a so funzione nantu à i tumori, è sò necessarie ulteriori ricerche.
Per risolve questi prublemi, avemu cuncipitu un metudu sensibile di separazione cellulare è spettrometria di massa in tandem per cromatografia liquida (LC-MS/MS) per studià diversi tipi di cellule (cumprese e cellule T CD4+ è CD8+) è ancu in è trà i tumori. I so metaboliti si estendenu nantu à e cellule in u listessu ambiente di ascite è tumore di u paziente. Usemu stu metudu in cunghjunzione cù a citometria di flussu ad alta dimensione è u sequenziamentu di RNA di cellule singole (scRNA-seq) per furnisce un ritrattu altamente risoltu di u statu metabolicu di queste pupulazioni chjave. Stu metudu hà rivelatu un aumentu significativu di u livellu di 1-metilnicotinamide (MNA) in e cellule T tumorali, è l'esperimenti in vitro anu dimustratu chì l'effettu immunomodulatorio di MNA nantu à a funzione di e cellule T era prima scunnisciutu. In generale, stu metudu revela l'interazzione metaboliche mutuale trà i tumori è e cellule immunitarie, è furnisce insights unichi nantu à i metaboliti di a regulazione immunitaria, chì ponu esse utili per u trattamentu di l'immunoterapia di u cancru ovarianu basata nantu à e cellule T. Opportunità di trattamentu.
Avemu utilizatu a citometria di flussu à alta dimensione per quantificà simultaneamente l'assorbimentu di glucosiu [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-deossiglucosio (2-NBDG) è l'attività mitocondriale [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) sò marcatori tipici affiancati chì distinguenu e cellule immunitarie è e pupulazioni di cellule tumorali (Tabella S2 è Figura S1A). Questa analisi hà dimustratu chì, paragunatu à e cellule T, l'ascite è e cellule tumorali anu livelli più alti di assorbimentu di glucosiu, ma anu differenze più chjuche in l'attività mitocondriale. L'assorbimentu mediu di glucosiu di e cellule tumorali [CD45-EpCAM (EpCAM)+] hè da trè à quattru volte quellu di e cellule T, è l'assorbimentu mediu di glucosiu di e cellule T CD4+ hè 1,2 volte quellu di e cellule T CD8+, ciò chì indica chì i linfociti infiltranti u tumore (TIL) anu esigenze metaboliche diverse ancu in u listessu TME (Figura 1A). In cuntrastu, l'attività mitocondriale in e cellule tumorali hè simile à quella di e cellule T CD4+, è l'attività mitocondriale di i dui tipi di cellule hè più alta di quella di e cellule T CD8+ (Figura 1B). In generale, questi risultati rivelanu u livellu metabolicu. L'attività metabolica di e cellule tumorali hè più alta di quella di e cellule T CD4+, è l'attività metabolica di e cellule T CD4+ hè più alta di quella di e cellule T CD8+. Malgradu questi effetti in tutti i tipi di cellule, ùn ci hè micca una differenza consistente in u statu metabolicu di e cellule T CD4+ è CD8+ o in e so proporzioni relative in l'ascite paragunatu à i tumori (Figura 1C). In cuntrastu, in a frazione di cellule CD45, a proporzione di cellule EpCAM+ in u tumore hè aumentata paragunatu à l'ascite (Figura 1D). Avemu ancu osservatu una chiara differenza metabolica trà i cumpunenti di e cellule EpCAM+ è EpCAM-. E cellule EpCAM+ (tumorali) anu un assorbimentu di glucosiu è una attività mitocondriale più alti cà e cellule EpCAM-, chì hè assai più alta di l'attività metabolica di i fibroblasti in e cellule tumorali in TME (Figura 1, E è F).
(A è B) Intensità mediana di fluorescenza (MFI) di l'assorbimentu di glucosiu (2-NBDG) (A) è attività mitocondriale di e cellule T CD4+ (MitoTracker rossu scuru) (B) Grafici rappresentativi (à manca) è dati tabulati (à diritta), cellule T CD8+ è cellule tumorali EpCAM+ CD45 da ascite è tumore. (C) U rapportu di cellule CD4+ è CD8+ (di cellule T CD3+) in ascite è tumore. (D) Proporzione di cellule tumorali EpCAM+ in ascite è tumore (CD45−). (E è F) Assorbimentu di glucosiu EpCAM+ CD45-tumore è EpCAM-CD45-matrice (2-NBDG) (E) è attività mitocondriale (MitoTracker rossu scuru) (F) Grafici rappresentativi (à manca) è dati tabulati (à diritta) Ascite è cellule tumorali. (G) Grafici rappresentativi di l'espressione di CD25, CD137 è PD1 per citometria di flussu. (H è I) Espressione di CD25, CD137 è PD1 nantu à i linfociti T CD4+ (H) è i linfociti T CD8+ (I). (J è K) Fenotipi ingenui, di memoria centrale (Tcm), effettrici (Teff) è di memoria effettrici (Tem) basati nantu à l'espressione di CCR7 è CD45RO. Immagini rappresentative (à manca) è dati tabulari (à diritta) di i linfociti T CD4+ (J) è i linfociti T CD8+ (K) in ascite è tumori. Valori P determinati da u t-test appaiatu (*P<0,05, **P<0,01 è ***P<0,001). A linea rapprisenta i pazienti currispondenti (n = 6). FMO, fluorescenza menu unu; MFI, intensità mediana di fluorescenza.
Ulteriori analisi anu rivelatu altre differenze significative trà u statu fenotipicu di e cellule T altamente risolte. L'attivazione (Figura 1, da G à I) è a memoria effettrice (Figura 1, J è K) in i tumori sò assai più frequenti chè l'ascite (proporzione di cellule T CD3+). In listessu modu, l'analisi di u fenotipu per via di l'espressione di marcatori d'attivazione (CD25 è CD137) è marcatori di deplezione [proteina di morte cellulare programmata 1 (PD1)] hà dimustratu chì, ancu s'è e caratteristiche metaboliche di queste pupulazioni sò diverse (Figura S1, da B à E), nisuna differenza metabolica significativa hè stata osservata in modu consistente trà sottoinsiemi ingenui, effettrici o di memoria (Figura S1, da F à I). Questi risultati sò stati cunfirmati utilizendu metudi di apprendimentu automaticu per assignà automaticamente fenotipi cellulari (21), chì anu rivelatu ancu a presenza di un gran numeru di cellule di midullu osseu (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) in l'ascite di u paziente (Figura S2A). Frà tutti i tipi di cellule identificati, sta pupulazione di cellule mieloidi hà mostratu u più altu assorbimentu di glucosiu è attività mitocondriale (Figura S2, da B à G). Questi risultati mettenu in evidenza e forti differenze metaboliche trà i multipli tipi di cellule truvate in ascite è tumori in i pazienti cù HGSC.
A sfida principale per capisce e caratteristiche metabonomiche di TIL hè a necessità di isolà campioni di cellule T di purezza, qualità è quantità sufficienti da i tumori. Studi recenti anu dimustratu chì i metudi di classificazione è d'arricchimentu di perle basati nantu à a citometria di flussu ponu purtà à cambiamenti in i profili di i metaboliti cellulari (22-24). Per superà stu prublema, avemu ottimizatu u metudu d'arricchimentu di perle per isolà è isolà TIL da u cancru ovarianu umanu resecatu chirurgicamente prima di l'analisi per LC-MS/MS (vede Materiali è Metodi; Figura 2A). Per valutà l'impattu generale di stu protocolu nantu à i cambiamenti di i metaboliti, avemu paragunatu i profili di i metaboliti di e cellule T attivate da donatori sani dopu a tappa di separazione di perle sopra citata cù e cellule chì ùn sò state separate da perle ma sò rimaste nantu à u ghjacciu. Questa analisi di cuntrollu di qualità hà trovu chì ci hè una alta currelazione trà queste duie cundizioni (r = 0,77), è a ripetibilità tecnica di u gruppu di 86 metaboliti hà una alta ripetibilità (Figura 2B). Dunque, sti metudi ponu fà analisi precise di i metaboliti in e cellule sottumesse à l'arricchimentu di u tipu cellulare, furnendu cusì a prima piattaforma ad alta risoluzione per identificà metaboliti specifici in HGSC, permettendu cusì à e persone di acquistà una cunniscenza più profonda di a specificità cellulare di u prugramma di metabolismu sessuale.
(A) Schema di l'arricchimentu di perle magnetiche. Prima di l'analisi per LC-MS/MS, e cellule saranu sottumesse à trè cicli consecutivi di arricchimentu di perle magnetiche o resteranu nantu à u ghjacciu. (B) L'effettu di u tipu d'arricchimentu nantu à l'abbundanza di metaboliti. A media di trè misurazioni per ogni tipu d'arricchimentu ± SE. A linea grisgia rapprisenta una relazione 1:1. A currelazione intra-classe (ICC) di misurazioni ripetute mostrata in l'etichetta di l'asse. NAD, nicotinamide adenina dinucleotide. (C) Schema di u flussu di travagliu di l'analisi di i metaboliti di i pazienti. L'ascite o i tumori sò raccolti da i pazienti è crioconservati. Una piccula parte di ogni campione hè stata analizata per citometria di flussu, mentre chì i campioni rimanenti sò stati sottumessi à trè cicli di arricchimentu per e cellule CD4+, CD8+ è CD45-. Queste frazioni cellulari sò state analizate cù LC-MS/MS. (D) Mappa di calore di l'abbundanza standardizata di metaboliti. U dendrogramma rapprisenta u raggruppamentu di Ward di distanze euclidee trà i campioni. (E) Analisi di i cumpunenti principali (PCA) di a mappa di i metaboliti di u campione, chì mostra trè repliche di ogni campione, i campioni di u listessu paziente sò cunnessi da una linea. (F) L'PCA di u prufilu di u metabolitu di u campione cundiziunatu nantu à u paziente (vale à dì, aduprendu ridondanza parziale); u tipu di campione hè limitatu da u scafu cunvessu. PC1, cumpunente principale 1; PC2, cumpunente principale 2.
Dopu, avemu applicatu stu metudu d'arricchimentu per analizà 99 metaboliti in e frazioni di cellule CD4+, CD8+ è CD45-in l'ascite primarie è i tumori di sei pazienti HGSC (Figura 2C, Figura S3A è Tavula S3 è S4). A pupulazione d'interessu rapprisenta da u 2% à u 70% di u grande campione originale di cellule viventi, è a proporzione di cellule varia assai trà i pazienti. Dopu avè separatu e perle, a frazione arricchita d'interessu (CD4+, CD8+ o CD45-) rapprisenta in media più di l'85% di tutte e cellule viventi in u campione. Stu metudu d'arricchimentu ci permette d'analizà e pupulazioni cellulari da u metabolismu di u tissutu tumorale umanu, ciò chì hè impussibile da fà da grandi campioni. Usendu stu protocolu, avemu determinatu chì l-chinurenina è l'adenosina, sti dui metaboliti immunosoppressivi ben caratterizati, eranu elevati in e cellule T tumorali o in e cellule tumorali (Figura S3, B è C). Dunque, sti risultati dimustranu a fedeltà è a capacità di a nostra tecnulugia di separazione cellulare è spettrometria di massa di truvà metaboliti biologicamente impurtanti in i tessuti di i pazienti.
A nostra analisi hà ancu revelatu una forte separazione metabolica di i tipi di cellule in i pazienti è trà di elli (Figura 2D è Figura S4A). In particulare, paragunatu à altri pazienti, u paziente 70 hà mostratu diverse caratteristiche metaboliche (Figura 2E è Figura S4B), chì indicanu chì ci pò esse una eterogeneità metabolica sustanziale trà i pazienti. Vale a pena nutà chì, paragunatu à altri pazienti (da 1,2 à 2 litri; Tabella S1), a quantità tutale di ascite raccolta in u paziente 70 (80 ml) era più chjuca. U cuntrollu di l'eterogeneità inter-paziente durante l'analisi di i cumpunenti principali (per esempiu, aduprendu l'analisi di ridondanza parziale) mostra cambiamenti consistenti trà i tipi di cellule, è i tipi di cellule è/o u microambiente sò chjaramente aggregati secondu u prufilu di u metabolitu (Figura 2F). L'analisi di i singoli metaboliti hà enfatizatu questi effetti è hà revelatu differenze significative trà i tipi di cellule è u microambiente. Vale a pena nutà chì a differenza più estrema osservata hè l'MNA, chì hè generalmente arricchitu in cellule CD45- è in cellule CD4+ è CD8+ chì infiltranu u tumore (Figura 3A). Per e cellule CD4+, questu effettu hè u più evidente, è l'MNA in e cellule CD8+ pare ancu esse fortemente affettatu da l'ambiente. Tuttavia, questu ùn hè micca impurtante, perchè solu trè di i sei pazienti ponu esse valutati per i punteggi CD8+ di u tumore. In più di l'MNA, in diversi tipi di cellule in ascite è tumori, altri metaboliti chì sò pocu caratterizati in TIL sò ancu ricchi in modu differenziale (Figure S3 è S4). Dunque, questi dati rivelanu un inseme promettente di metaboliti immunomodulatori per ulteriori ricerche.
(A) Cuntenutu nurmalizatu di MNA in e cellule CD4+, CD8+ è CD45- da ascite è tumore. U graficu à scatula mostra a mediana (linea), l'intervallu interquartile (cerniera di u quadru) è l'intervallu di dati, finu à 1,5 volte l'intervallu interquartile (babbi di u quadru). Cum'è descrittu in Materiali è Metodi di u Paziente, aduprate u valore limma di u paziente per determinà u valore P (*P<0,05 è **P<0,01). (B) Schema di u metabolismu di l'MNA (60). Metaboliti: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-omocisteina; NA, nicotinamide; MNA, 1-metilnicotinamide; 2-PY, 1-metil-2-piridone-5-carbossammide; 4-PY, 1-metil-4-piridone-5-carbossammide; NR, nicotinamide ribosio; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enzimi (verdi): NNMT, nicotinamide N-metiltransferasi; SIRT, sirtuine; NAMPT, nicotinamide fosforibosil transferasi; AOX1, aldeide ossidasi 1; NRK, nicotinamide riboside chinasi; NMNAT, nicotinamide mononucleotide adenilato transferasi; Pnp1, purina nucleoside fosforilasi. (C) t-SNE di scRNA-seq di ascite (grigia) è tumore (rossa; n = 3 pazienti). (D) Espressione di NNMT in diverse pupulazioni cellulari identificate cù scRNA-seq. (E) Espressione di NNMT è AOX1 in SK-OV-3, rene embrionale umanu (HEK) 293T, cellule T è cellule T trattate cù MNA. L'espressione piegata hè mostrata in relazione à SK-OV-3. U schema d'espressione cù SEM hè mostratu (n = 6 donatori sani). I valori Ct più grandi di 35 sò cunsiderati non rilevabili (UD). (F) Espressione di SLC22A1 è SLC22A2 in SK-OV-3, HEK293T, cellule T è cellule T trattate cù 8 mM MNA. L'espressione piegata hè mostrata in relazione à SK-OV-3. U schema d'espressione cù SEM hè mostratu (n = 6 donatori sani). I valori Ct superiori à 35 sò cunsiderati non rilevabili (UD). (G) Cuntenutu di MNA cellulare in cellule T donatrici sane attivate dopu à 72 ore d'incubazione cù MNA. U schema d'espressione cù SEM hè mostratu (n = 4 donatori sani).
L'MNA hè pruduttu trasferendu u gruppu metilu da S-adenosil-1-metionina (SAM) à nicotinamide (NA) da a nicotinamide N-metiltransferasi (NNMT; Figura 3B). L'NNMT hè sovraespressu in una varietà di cancri umani è hè assuciatu à a proliferazione, l'invasione è a metastasi (25-27). Per capisce megliu a fonte di MNA in i linfociti T in TME, avemu utilizatu scRNA-seq per caratterizà l'espressione di NNMT in i tipi di cellule in l'ascite è i tumori di trè pazienti HGSC (Tabella S5). L'analisi di circa 6.500 cellule hà dimustratu chì in l'ascite è in l'ambienti tumorali, l'espressione di NNMT era limitata à e presunte pupulazioni di fibroblasti è cellule tumorali (Figura 3, C è D). Vale a pena nutà chì ùn ci hè micca una espressione evidente di NNMT in alcuna pupulazione chì esprime PTPRC (CD45 +) (Figura 3D è Figura S5A), ciò chì indica chì l'MNA rilevatu in u spettru di u metabolitu hè statu introduttu in i linfociti T. L'espressione di l'aldeide ossidasi 1 (AOX1) cunverte u MNA in 1-metil-2-piridone-5-carboxamide (2-PYR) o 1-metil-4-piridone-5-carboxamide (4-PYR); Figura 3B) hè ancu limitata à a pupulazione di fibroblasti chì esprimenu COL1A1 (Figura S5A), chì inseme indicanu chì e cellule T ùn anu micca a capacità di u metabolismu convenzionale di u MNA. U mudellu d'espressione di sti geni ligati à u MNA hè statu verificatu utilizendu un secondu inseme di dati cellulari indipendenti da ascite di pazienti HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Inoltre, l'analisi quantitativa di a reazione à catena di a polimerasi (qPCR) di e cellule T donatrici sane trattate cù MNA hà dimustratu chì, paragunatu à e cellule tumorali ovariche SK-OV-3 di cuntrollu, NNMT o AOX1 ùn eranu quasi micca espressi (Figura 3E). Sti risultati inaspettati indicanu chì u MNA pò esse secretu da fibroblasti o tumori in e cellule T adiacenti in TME.
Ancu s'è i candidati includenu a famiglia di trasportatori di cationi organici da 1 à 3 (OCT1, OCT2 è OCT3) codificati da a famiglia di trasportatori solubili 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 è SLC22A3), i trasportatori potenziali di MNA sò ancu indefiniti (28). A QPCR di mRNA da cellule T donatrici sane hà mostratu bassi livelli di espressione di SLC22A1 ma livelli indetectabili di SLC22A2, ciò chì hà cunfirmatu chì era statu precedentemente riportatu in a literatura (Figura 3F) (29). In cuntrastu, a linea cellulare tumorale ovariana SK-OV-3 hà espressu alti livelli di i dui trasportatori (Figura 3F).
Per pruvà a pussibilità di i linfociti T chì anu a capacità d'assorbe l'MNA stranieru, i linfociti T donatori sani sò stati cultivati ​​per 72 ore in presenza di diverse concentrazioni di MNA. In assenza di MNA esogenu, u cuntenutu cellulare di MNA ùn pò esse rilevatu (Figura 3G). Tuttavia, i linfociti T attivati ​​trattati cù MNA esogenu anu mostratu un aumentu dipendente da a dose di u cuntenutu di MNA in e cellule, finu à 6 mM MNA (Figura 3G). Questu risultatu indica chì, malgradu u bassu livellu d'espressione di u trasportatore è a mancanza di u principale enzima rispunsevule di u metabolismu intracellulare di l'MNA, TIL pò ancu assorbe l'MNA.
U spettru di i metaboliti in i linfociti T di i pazienti è l'esperimenti d'assorbimentu di MNA in vitro aumentanu a pussibilità chì i fibroblasti assuciati à u cancru (CAF) secretinu MNA è e cellule tumorali possinu regulà u fenotipu è a funzione di TIL. Per determinà l'effettu di MNA nantu à i linfociti T, i linfociti T donatori sani sò stati attivati ​​in vitro in presenza o assenza di MNA, è a so proliferazione è a pruduzzione di citochine sò state valutate. Dopu à 7 ghjorni di aghjunta di MNA à a dosa più alta, u numeru di raddoppiu di a pupulazione hè statu moderatamente riduttu, mentre chì u vigore hè statu mantinutu à tutte e dosi (Figura 4A). Inoltre, u trattamentu di MNA esogenu hà risultatu in un aumentu di a proporzione di linfociti T CD4+ è CD8+ chì esprimenu u fattore di necrosi tumorale-α (TNFα; Figura 4B). In cuntrastu, a pruduzzione intracellulare di IFN-γ hè stata significativamente ridutta in i linfociti T CD4+, ma micca in i linfociti T CD8+, è ùn ci hè statu alcun cambiamentu significativu in l'interleuchina 2 (IL-2; Figura 4, C è D). Dunque, u test immunosorbente ligatu à l'enzimi (ELISA) di i supernatanti di queste culture di cellule T trattate cù MNA hà mostratu un aumentu significativu di TNFα, una diminuzione di IFN-γ, è nisun cambiamentu in IL-2 (Figura 4, da E à G). A diminuzione di IFN-γ indica chì MNA pò ghjucà un rolu in l'inibizione di l'attività antitumorale di e cellule T. Per simulà l'effettu di MNA nantu à a citotossicità mediata da e cellule T, e cellule T di u receptore di l'antigenu chimericu (FRα-CAR-T) chì miranu u receptore di u folatu α è e cellule CAR-T (GFP) regulate da e cellule di a proteina fluorescente verde (GFP) -CAR-T) sò prodotte da cellule mononucleari di u sangue perifericu (PBMC) di donatori sani. E cellule CAR-T sò state cultivate per 24 ore in presenza di MNA, è dopu co-cultivate cù cellule tumorali ovariche umane SK-OV-3 chì esprimenu u receptore di u folatu α à un rapportu effettore-bersagliu di 10:1. U trattamentu MNA hà risultatu in una diminuzione significativa di l'attività di uccisione di e cellule FRα-CAR-T, chì era simile à e cellule FRα-CAR-T trattate cù adenosina (Figura 4H).
(A) Conteggio tutale di cellule vitali è raddoppiu di a pupulazione (PD) direttamente da a cultura u ghjornu 7. U graficu à barre rapprisenta a media + SEM di sei donatori sani. Rapprisenta i dati da almenu n = 3 esperimenti indipendenti. (B à D) CD3/CD28 è IL-2 sò stati aduprati per attivà e cellule T à e so rispettive concentrazioni di MNA per 7 ghjorni. Prima di l'analisi, e cellule sò state stimulate cù PMA/ionomicina cù GolgiStop per 4 ore. Espressione di TNFα (B) in cellule T. Esempiu d'imagine (à manca) è dati tabulari (à diritta) di l'espressione di TNFα in cellule viventi. Espressione di IFN-γ (C) è IL-2 (D) in cellule T. L'espressione di citochine hè stata misurata per citometria di flussu. U graficu à barre rapprisenta a media (n = 6 donatori sani) + SEM. Aduprate l'analisi unidirezionale di a varianza è misure ripetute (*P<0,05 è **P<0,01) per determinà u valore P. Rapprisenta i dati da almenu n = 3 esperimenti indipendenti. (E à G) CD3/CD28 è IL-2 sò stati aduprati per attivà e cellule T à e so rispettive concentrazioni di MNA per 7 ghjorni. U mezu hè statu raccoltu prima è dopu à 4 ore di stimulazione PMA/ionomicina. E concentrazioni di TNFα (E), IFN-γ (F) è IL-2 (G) sò state misurate da ELISA. U graficu à barre rapprisenta a media (n = 5 donatori sani) + SEM. Valore P determinatu aduprendu l'analisi di varianza à una via è misurazioni ripetute (*P<0,05). A linea punteggiata indica u limite di rilevazione di a rilevazione. (H) Saggio di lisi cellulare. E cellule FRα-CAR-T o GFP-CAR-T sò state aghjustate cù adenosina (250 μM) o MNA (10 mM) per 24 ore, o lasciate senza trattamentu (Ctrl). A percentuale di uccisione di e cellule SK-OV-3 hè stata misurata. Valore P determinatu da u test t di Welch (*P<0,5 è **P<0,01).
Per ottene una comprensione meccanistica di a regulazione di l'espressione di TNFα dipendente da MNA, sò stati valutati i cambiamenti in l'mRNA di TNFα di e cellule T trattate cù MNA (Figura 5A). E cellule T donatrici sane trattate cù MNA anu mostratu un aumentu di duie volte di i livelli di trascrizione di TNFα, chì indica chì MNA dipende da a regulazione trascrizionale di TNFα. Per investigà questu pussibule mecanismu regulatoriu, dui fattori di trascrizione cunnisciuti chì regulanu TNFα, vale à dì u fattore nucleare di e cellule T attivate (NFAT) è a proteina specifica 1 (Sp1), sò stati valutati in risposta à u ligame di MNA à u promotore TNFα prossimale (30). U promotore TNFα cuntene 6 siti di ligame NFAT identificati è 2 siti di ligame Sp1, chì si sovrappongono in un situ [-55 coppie di basi (bp) da u cap 5'] (30). L'immunoprecipitazione di cromatina (ChIP) hà mostratu chì quandu hè trattata cù MNA, u ligame di Sp1 à u promotore TNFα hè aumentatu di trè volte. L'incorporazione di NFAT hè ancu aumentata è s'hè avvicinata à l'impurtanza (Figura 5B). Questi dati indicanu chì u MNA regula l'espressione di TNFα per via di a trascrizione di Sp1, è in una misura minore l'espressione di NFAT.
(A) In paragone cù i linfociti T cultivati ​​senza MNA, u cambiamentu di volta di l'espressione di TNFα in i linfociti T trattati cù MNA. U schema di espressione cù SEM hè mostratu (n = 5 donatori sani). Rapprisenta dati da almenu n = 3 esperimenti indipendenti. (B) U promotore TNFα di i linfociti T trattati cù o senza 8 mM MNA dopu chì NFAT è Sp1 sò stati cumminati cù (Ctrl) è stimulazione PMA/ionomicina per 4 ore. L'immunoglobulina G (IgG) è H3 sò stati aduprati cum'è cuntrolli negativi è pusitivi per l'immunoprecipitazione, rispettivamente. A quantificazione di ChIP hà dimustratu chì u ligame di Sp1 è NFAT à u promotore TNFα in e cellule trattate cù MNA hè aumentatu parechje volte paragunatu à u cuntrollu. Rapprisenta dati da almenu n = 3 esperimenti indipendenti. Valore P determinatu da più test t (*** P <0,01). (C) In paragone cù l'ascite di HGSC, i linfociti T (non citotossichi) anu dimustratu una maggiore espressione di TNF in u tumore. I culori rapprisentanu diversi pazienti. E cellule visualizate sò state campionate à casu à 300 è jitterate per limità u sovraccaricu (** Padj = 0.0076). (D) Modellu prupostu di MNA per u cancru di l'ovaru. U MNA hè pruduttu in e cellule tumorali è i fibroblasti in TME è hè assorbitu da i linfociti T. U MNA aumenta u ligame di Sp1 à u promotore TNFα, purtendu à una maggiore trascrizione di TNFα è à a pruduzzione di citochine TNFα. U MNA provoca ancu una diminuzione di IFN-γ. L'inibizione di a funzione di i linfociti T porta à una riduzione di a capacità di uccisione è à una crescita accelerata di u tumore.
Sicondu i rapporti, u TNFα hà effetti antitumorali è antitumorali front-and-back-dependent, ma hà un rolu ben cunnisciutu in a prumuzione di a crescita è di a metastasi di u cancru ovarianu (31-33). Sicondu i rapporti, a cuncentrazione di TNFα in l'ascite è i tessuti tumorali in i pazienti cun cancru ovarianu hè più alta chè quella in i tessuti benigni (34-36). In termini di mecanismu, u TNFα pò regulà l'attivazione, a funzione è a proliferazione di i globuli bianchi, è cambià u fenotipu di e cellule cancerose (37, 38). In cunfurmità cù questi risultati, l'analisi di l'espressione genica differenziale hà dimustratu chì u TNF era significativamente sovraregulatu in e cellule T in i tessuti tumorali paragunatu à l'ascite (Figura 5C). L'aumentu di l'espressione di TNF era evidente solu in e pupulazioni di cellule T cun un fenotipu non citotossicu (Figura S5A). In riassuntu, questi dati sustenenu l'idea chì u MNA hà doppi effetti immunosoppressivi è di prumuzione di u tumore in l'HGSC.
A marcatura fluorescente basata annantu à a citometria di flussu hè diventata u metudu principale per studià u metabolismu di i TIL. Quessi studii anu dimustratu chì, paragunatu à i linfociti di u sangue perifericu o à e cellule T di l'organi linfoidi secundarii, i TIL murini è umani anu una tendenza più alta à assimilà u glucosiu (4, 39) è a perdita graduale di a funzione mitocondriale (19, 40). Ancu s'è no avemu osservatu risultati simili in questu studiu, u sviluppu chjave hè di paragunà u metabolismu di e cellule tumorali è di i TIL di u listessu tissutu tumorale resecatu. In cunfurmità cù alcuni di sti rapporti precedenti, e cellule tumorali (CD45-EpCAM+) di l'ascite è di i tumori anu un assorbimentu di glucosiu più altu chè e cellule T CD8+ è CD4+, ciò chì sustene chì l'altu assorbimentu di glucosiu di e cellule tumorali pò esse paragunatu cù e cellule T. U cuncettu di cumpetizione di e cellule T. TME. Tuttavia, l'attività mitocondriale di e cellule tumorali hè più alta di quella di e cellule T CD8+, ma l'attività mitocondriale hè simile à quella di e cellule T CD4+. Quessi risultati rinfurzanu u tema emergente chì u metabolismu ossidativu hè impurtante per e cellule tumorali (41, 42). Suggeriscenu ancu chì e cellule T CD8+ possinu esse più suscettibili à a disfunzione ossidativa chè e cellule T CD4+, o chì e cellule T CD4+ possinu aduprà fonti di carbone diverse da u glucosiu per mantene l'attività mitocondriale (43, 44). Ci vole à nutà chì ùn avemu osservatu alcuna differenza in l'assorbimentu di glucosiu o in l'attività mitocondriale trà l'effettori T CD4+, a memoria di l'effettore T è e cellule T di memoria centrale in l'ascite. In listessu modu, u statu di differenziazione di e cellule T CD8+ in i tumori ùn hà nunda à chì vede cù i cambiamenti in l'assorbimentu di glucosiu, mettendu in risaltu a differenza significativa trà e cellule T cultivate in vitro è TIL umane in vivo (22). Queste osservazioni sò state ancu cunfirmate da l'usu di l'allocazione automatica imparziale di a pupulazione cellulare, chì hà rivelatu ancu chì e cellule CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ cù un assorbimentu di glucosiu è una attività mitocondriale più elevati cà e cellule tumorali sò prevalenti ma anu una pupulazione cellulare metabolica attiva. Questa pupulazione pò rapprisintà a presunta sottopupulazione di cellule soppressorie mieloidi o cellule dendritiche plasmacitoidi identificate in l'analisi scRNA-seq. Ancu s'è tramindui sò stati signalati in tumori ovariani umani [45], anu sempre bisognu di più travagliu per discrive sta sottupopulazione mieloide.
Ancu s'è i metudi basati nantu à a citometria di flussu ponu chiarificà e differenze generali in u metabolismu di u glucosiu è ossidativu trà i tipi di cellule, i metaboliti precisi prudutti da u glucosiu o altre fonti di carbone per u metabolismu mitocondriale in TME ùn sò ancu stati determinati. L'assignazione di a presenza o di l'assenza di metaboliti à un datu sottoinsieme TIL richiede a purificazione di a pupulazione cellulare da u tissutu escisatu. Dunque, u nostru metudu d'arricchimentu cellulare cumminatu cù a spettrometria di massa pò furnisce insights nantu à i metaboliti chì sò arricchiti differenzialmente in e cellule T è e pupulazioni di cellule tumorali in campioni di pazienti currispondenti. Ancu s'è questu metudu hà vantaghji rispetto à l'urdinamentu cellulare attivatu da fluorescenza, certe biblioteche di metaboliti ponu esse affettate per via di a stabilità inerente è / o di u rapidu tassu di turnover (22). Tuttavia, u nostru metudu hè statu capace di identificà dui metaboliti immunosoppressivi ricunnisciuti, adenosina è kynurenina, perchè varianu assai trà i tipi di campioni.
A nostra analisi metabonumica di i tumori è di i sottotipi TIL furnisce più infurmazioni nantu à u rolu di i metaboliti in u TME ovarianu. Prima, aduprendu a citometria di flussu, avemu determinatu chì ùn ci era nisuna differenza in l'attività mitocondriale trà i tumori è e cellule T CD4+. Tuttavia, l'analisi LC-MS/MS hà rivelatu cambiamenti significativi in ​​l'abbundanza di metaboliti trà queste pupulazioni, indicendu chì e cunclusioni nantu à u metabolismu TIL è a so attività metabolica generale richiedenu una interpretazione attenta. Siconda, l'MNA hè u metabolitu cù a più grande differenza trà e cellule CD45 è e cellule T in l'ascite, micca i tumori. Dunque, a compartimentazione è a situazione di u tumore ponu avè effetti diversi nantu à u metabolismu TIL, ciò chì mette in risaltu a pussibile eterogeneità in un datu microambiente. Terzu, l'espressione di l'enzima NNMT chì produce MNA hè principalmente limitata à CAF, chì hè cellule tumorali in misura minore, ma livelli di MNA rilevabili sò osservati in cellule T derivate da tumori. A sovraespressione di NNMT in CAF ovarianu hà un effettu cunnisciutu di prumuzione di u cancru, in parte per via di a prumuzione di u metabolismu CAF, l'invasione tumorale è a metastasi (27). Ancu s'è u livellu generale di TIL hè moderatu, l'espressione di NNMT in CAF hè strettamente ligata à u sottotipu mesenchimale di Cancer Genome Atlas (TCGA), chì hè assuciatu à una prognosi sfavurevule (27, 46, 47). Infine, l'espressione di l'enzima AOX1 rispunsevule di a degradazione di MNA hè ancu limitata à a pupulazione CAF, ciò chì indica chì i linfociti T ùn anu micca a capacità di metabolizà MNA. Quessi risultati sustenenu l'idea chì, ancu s'è hè necessariu più travagliu per verificà sta scuperta, alti livelli di MNA in i linfociti T ponu indicà a presenza di un microambiente CAF immunosoppressivu.
Datu u bassu livellu d'espressione di i trasportatori di MNA è i livelli indetectabili di e proteine ​​chjave implicate in u metabolismu di l'MNA, a presenza di MNA in i linfociti T hè inaspettata. Né NNMT né AOX1 anu pussutu esse rilevati da l'analisi scRNA-seq è a qPCR mirata di duie coorti indipendenti. Quessi risultati indicanu chì l'MNA ùn hè micca sintetizatu da i linfociti T, ma assorbitu da u TME circundante. L'esperimenti in vitro mostranu chì i linfociti T tendenu à accumulà MNA esogenu.
I nostri studii in vitro anu dimustratu chì u MNA esogenu induce l'espressione di TNFα in i linfociti T è aumenta u ligame di Sp1 à u promotore TNFα. Ancu s'è u TNFα hà funzioni sia antitumorali sia antitumorali, in u cancru ovarianu, u TNFα pò prumove a crescita di u cancru ovarianu (31-33). A neutralizazione di u TNFα in a cultura di cellule tumorali ovariane o l'eliminazione di u signale TNFα in i mudelli di topi pò migliurà a produzzione di citochine infiammatorie mediate da TNFα è inibisce a crescita tumorale (32, 35). Dunque, in questu casu, u MNA derivatu da TME pò agisce cum'è un metabolitu pro-infiammatoriu attraversu un mecanismu dipendente da TNFα attraversu u ciclu autocrinu, prumove cusì l'occorrenza è a diffusione di u cancru ovarianu (31). Basatu annantu à sta pussibilità, u bloccu di TNFα hè studiatu cum'è un potenziale agente terapeuticu per u cancru ovarianu (37, 48, 49). Inoltre, u MNA altera a citotossicità di e cellule CAR-T per e cellule tumorali ovariane, furnendu ulteriori prove per a soppressione immunitaria mediata da MNA. Cullettivamente, sti risultati suggerenu un mudellu in u quale i tumori è e cellule CAF secretanu MNA in TME extracellulare. Attraversu (i) a stimulazione di a crescita di u cancru ovarianu indotta da TNF è (ii) l'inibizione di l'attività citotossica di e cellule T indotta da MNA, questu puderia avè un doppiu effettu tumorale (Figura 5D).
In cunclusione, applicendu una cumbinazione di arricchimentu cellulare rapidu, sequenziamentu di cellule singole è prufilatura metabolica, questu studiu hà revelatu l'enormi differenze immunometabolomiche trà i tumori è e cellule d'ascite in i pazienti HGSC. Questa analisi cumpleta hà dimustratu chì ci sò differenze in l'assorbimentu di glucosiu è l'attività mitocondriale trà e cellule T, è hà identificatu u MNA cum'è un metabolitu regulatoriu immune autonomu non cellulare. Quessi dati anu un impattu nantu à cumu u TME affetta u metabolismu di e cellule T in i cancri umani. Ancu s'è a cumpetizione diretta per i nutrienti trà e cellule T è e cellule cancerose hè stata signalata, i metaboliti ponu ancu agisce cum'è regulatori indiretti per prumove a progressione di u tumore è pussibilmente supprime e risposte immunitarie endogene. L'ulteriore descrizzione di u rolu funzionale di questi metaboliti regulatori pò apre strategie alternative per migliurà a risposta immune antitumorale.
I campioni di i pazienti è i dati clinichi sò stati ottenuti per mezu di u repositoriu di tessuti tumorali di u cancru BC certificatu da a Canadian Tissue Repository Network. Sicondu u protocolu appruvatu da u BC Cancer Research Ethics Committee è l'Università di a Columbia Britannica (H07-00463), tutti i campioni è i dati clinichi di i pazienti anu ottenutu un cunsensu scrittu infurmatu o anu rinunciatu formalmente à u so cunsensu. I campioni sò almacenati in a BioBank certificata (BRC-00290). E caratteristiche dettagliate di i pazienti sò mostrate in e Tabelle S1 è S5. Per a crioconservazione, un bisturi hè adupratu per decompone meccanicamente u campione di tumore di u paziente è poi spinghjelu à traversu un filtru di 100 micron per ottene una sospensione di cellule singole. L'ascite di u paziente hè stata centrifugata à 1500 rpm per 10 minuti à 4°C per pellettà e cellule è rimuovere u surnatante. E cellule ottenute da tumori è ascite sò state crioconservate in 50% sieru AB umanu inattivatu da u calore (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) è 10% dimetilsulfossido. Queste sospensioni di cellule singole conservate sò state scongelate è aduprate per a metabolomica è a determinazione di i metaboliti descritti quì sottu.
U mezu cumpletu hè custituitu da 0,22 μm filtrati 50:50 supplementati cù RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) supplementati cù 10% di sieru AB umanu inattivatu da u calore (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x soluzione di penicillina streptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) è 50 μMB-mercaptoetanolo. AimV (Invitrogen) hè supplementatu cù 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) è 2 mM l-glutamina (Thermo Fisher Scientific). U buffer di colorazione di u citometru di flussu era custituitu da 0,22 μm di soluzione salina tamponata cù fosfatu filtratu (PBS; Invitrogen) supplementata cù 3% di sieru AB umanu inattivatu da u calore (Sigma). U buffer d'arricchimentu cellulare hè cumpostu di PBS filtratu 0,22 μm è supplementatu cù 0,5% di sieru AB umanu inattivatu da u calore (Sigma-Aldrich).
In un mezu cumpletu à 37°C, e cellule sò state culurite cù 10 nM MT DR è 100 μM 2-NBDG per 30 minuti. Dopu, e cellule sò state culurite cù u colorante di viabilità eF506 à 4°C per 15 minuti. Risuspende e cellule in FC Block (eBioscience) è Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluite in un buffer di culuratione per citometria di flussu (secondu l'istruzzioni di u fabricatore) è incubate per 10 minuti à temperatura ambiente. Colorate e cellule cù un inseme d'anticorpi (Tabella S2) in un buffer di culuratione per citometria di flussu à 4°C per 20 minuti. Risuspende e cellule in un buffer di culuratione per citometria di flussu (Cytek Aurora; cunfigurazione 3L-16V-14B-8R) prima di l'analisi. Aduprate SpectroFlo è FlowJo V10 per analizà i dati di u conteggio cellulare, è aduprate GraphPad Prism 8 per creà i dati. L'intensità mediana di fluorescenza (MFI) di 2-NBDG è MT DR hè stata log-normalizzata, è dopu hè statu utilizatu un test t appaiatu per l'analisi statistica per tene contu di i pazienti currispondenti. Eliminate tutte e pupulazioni cù menu di 40 eventi da l'analisi; inserite un valore MFI di 1 per qualsiasi valore negativu prima di realizà l'analisi statistica è a visualizazione di i dati.
Per cumplementà a strategia di gating manuale di u pannellu di prucessu sopra, avemu utilizatu l'annotazione cumpleta da l'arburu di restrizione di forma (FAUST) (21) per assignà automaticamente e cellule à a pupulazione dopu avè eliminatu e cellule morte in FlowJo. Gestiamu manualmente l'output per fusionà e pupulazioni chì parenu esse mal allocate (cumbinendu PD1+ cù e cellule tumorali PD1) è e pupulazioni ritenute. Ogni campione cuntene una media di più di u 2% di cellule, per un totale di 11 pupulazioni.
A centrifugazione di densità di gradiente di Ficoll hè stata aduprata per separà i PBMC da i prudutti di separazione di i leucociti (STEMCELL Technologies). I linfociti T CD8+ sò stati isolati da i PBMC aduprendu CD8 MicroBeads (Miltenyi) è espansi in mezu cumpletu aduprendu TransAct (Miltenyi) per 2 settimane secondu l'istruzzioni di u fabricatore. E cellule sò state lasciate riposà per 5 ghjorni in mezu cumpletu chì cuntene IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), è dopu ristimulate cù TransAct. U ghjornu 7, secondu l'istruzzioni di u fabricatore, i CD45 MicroBeads umani (Miltenyi) sò stati aduprati per arricchisce e cellule in trè cicli consecutivi. E cellule sò state aliquotate per l'analisi di citometria di flussu (cum'è descrittu sopra), è un milione di cellule sò state aliquotate trè volte per l'analisi LC-MS/MS. I campioni sò stati processati da LC-MS/MS cum'è descrittu quì sottu. Avemu stimatu u valore di u metabolitu mancante cù un numeru di ioni di 1.000. Ogni campione hè nurmalizatu da u numeru tutale di ioni (TIC), cunvertitu logaritmicamente è nurmalizatu automaticamente in MetaboAnalystR prima di l'analisi.
A sospensione di una sola cellula di ogni paziente hè stata scongelata è filtrata attraversu un filtru di 40 μm in un mezu cumpletu (cum'è descrittu sopra). Sicondu u protocolu di u fabricatore, trè cicli consecutivi di selezzione pusitiva per separazione di perle magnetiche utilizendu MicroBeads (Miltenyi) sò stati utilizati per arricchisce i campioni per e cellule CD8+, CD4+ è CD45- (nantu à u ghjacciu). In breve, e cellule sò risospese in un buffer d'arricchimentu cellulare (cum'è descrittu sopra) è cuntate. E cellule sò state incubate cù perle CD8 umane, perle CD4 umane o perle CD45 umane (Miltenyi) à 4°C per 15 minuti, è dopu lavate cù un buffer d'arricchimentu cellulare. U campione hè passatu attraversu a colonna LS (Miltenyi), è e frazioni pusitive è negative sò raccolte. Per riduce a durata è massimizà a fase di ricuperazione cellulare, a frazione CD8 hè poi aduprata per u secondu ciclu di arricchimentu CD4+, è a frazione CD4 hè aduprata per u susseguente arricchimentu CD45. Mantene a suluzione nantu à u ghjacciu durante tuttu u prucessu di separazione.
Per preparà i campioni per l'analisi di i metaboliti, e cellule sò state lavate una volta cù una soluzione salina ghiacciata, è 1 ml di metanolu à 80% hè statu aghjuntu à ogni campione, poi vortexatu è congelatu rapidamente in azotu liquidu. I campioni sò stati sottumessi à trè cicli di congelazione-scongelazione è centrifugati à 14.000 rpm per 15 minuti à 4°C. U surnatante chì cuntene i metaboliti hè evaporatu finu à seccu. I metaboliti sò stati ridissolti in 50 μl di acidu formicu à 0,03%, vortexati per mischjà, è poi centrifugati per rimuovere i detriti.
Estrae i metaboliti cum'è descrittu sopra. Trasferisce u supernatante in una buttiglia di cromatografia liquida ad alte prestazioni per a ricerca metabolomica. Aduprate un protocolu di trattamentu aleatoriu per trattà ogni campione cù un numeru simile di cellule per prevene l'effetti batch. Avemu realizatu una valutazione qualitativa di i metaboliti globali publicati prima nantu à u Spettrometru di Massa à Triplu Quadrupolo AB SCIEX QTRAP 5500 (50). L'analisi cromatografica è l'integrazione di l'area di piccu sò state realizate utilizendu u software MultiQuant versione 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Un contu di ioni di 1000 hè statu utilizatu per stimà u valore di u metabolitu mancante, è u TIC di ogni campione hè statu utilizatu per calculà l'area di piccu nurmalizzata di ogni metabolitu rilevatu per curregge i cambiamenti introdutti da l'analisi strumentale da u processu di u campione. Dopu chì u TIC hè nurmalizatu, MetaboAnalystR (51) (parametru predefinitu) hè utilizatu per a cunversione logaritmica è a scalatura automatica di a linea di norma. Avemu utilizatu PCA cù u pacchettu R veganu per realizà analisi esplorative di e differenze di metabolomi trà i tipi di campioni, è avemu utilizatu analisi di ridondanza parziale per analizà i pazienti. Aduprate u metudu Ward per custruisce un dendrogramma di mappa di calore per raggruppà a distanza euclidea trà i campioni. Avemu utilizatu limma (52) nantu à l'abbundanza di metaboliti standardizati per identificà metaboliti differenzialmente abbundanti in tuttu u tipu cellulare è u microambiente. Per simplificà a spiegazione, usemu u parametru mediu di gruppu per specificà u mudellu, è cunsideremu i tipi di cellule in u microambiente cum'è ogni gruppu (n = 6 gruppi); per u test di significatività, avemu realizatu trè misurazioni ripetute per ogni metabolitu. Per evità a falsa replicazione, u paziente hè statu inclusu cum'è un ostaculu in u disignu di limma. Per verificà e differenze di metaboliti trà diversi pazienti, avemu adattatu u mudellu limma includendu i pazienti in un modu fissu. Ripurtemu a significatività di u cuntrastu predefinitu trà u tipu di cellula è u microambiente di Padj <0.05 (currezzione Benjamini-Hochberg).
Dopu l'arricchimentu di vigore cù u Kit di Rimozione di Cellule Morte Miltenyi (viabilità >80%), u sequenziamentu di u trascrittoma di una sola cellula hè statu realizatu nantu à l'ascite è i campioni di tumore congelati vivi totali utilizendu un protocolu di espressione genica 10x 5′. Cinque casi cù tumori è ascite currispondenti sò stati analizati, ancu s'è a bassa viabilità di un campione di tumore hà impeditu a so inclusione. Per ottene selezioni multiple di pazienti, avemu cumminatu i campioni di ogni paziente in e corsie di u controller di cromu 10x, è avemu analizatu l'ascite è i siti di tumore separatamente. Dopu u sequenziamentu [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp paired end (PE), genomu di Quebec; una media di 73.488 è 41.378 letture per cellula per tumore è ascite rispettivamente]], avemu utilizatu CellSNP è Vireo (53) (basatu annantu à CellSNP cum'è U SNP umanu cumunu (VCF) furnitu da GRCh38 hè assignatu una identità di donatore. Usemu SNPRelate per deduce l'identità più vicina (IBS) di u statu di genotipu di u paziente (IBS), escludendu e cellule micca assignate è e cellule identificate cum'è duplex è i donatori currispondenti trà ascite è campioni di tumore (54). Nantu à a basa di questu compitu, avemu ritenutu trè casi cù una rappresentazione cellulare abbundante in u tumore è l'ascite per l'analisi à valle. Dopu avè realizatu una tappa di filtrazione di massa in l'imballu BioConductor scater (55) è scran (56), questu hà datu 6975 cellule (2792 è 4183 cellule da tumore è ascite, rispettivamente) per l'analisi. Usemu u clustering Louvain di igraph (57) di a rete di vicini più vicini spartuti (SNN) basatu annantu à a distanza di Jaccard da e cellule di u cluster da espressione. I gruppi sò stati annotati manualmente à i tipi di cellule putativi basati annantu à l'espressione di u genu marcatore è visualizati cù t-SNE. E cellule T citotossiche sò definite da l'espressione di CD8A è GZMA, escludendu i sottogruppi cù bassa espressione di proteine ​​ribosomiali. Avemu accessu à i dati publicati di Izar et al. (16), cumprese a so incorporazione di t-SNE, pò cuntrullà a sovrapposizione di espressione trà i marcatori di e cellule immunitarie è l'espressione di NNMT.
I PBMC sò stati separati da i prudutti di separazione di i leucociti (STEMCELL Technologies) per centrifugazione di densità à gradiente di Ficoll. E cellule CD3+ sò state isolate da i PBMC utilizendu perle CD3 (Miltenyi). In presenza o assenza di MNA, e cellule CD3+ sò state attivate cù CD3 ligatu à a piastra (5μg/ml), CD28 solubile (3μg/ml) è IL-2 (300 U/ml; Proleukin). L'ultimu ghjornu di espansione, a viabilità (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) è a proliferazione (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) sò state valutate per citometria di flussu. Valutà a funzione di l'effettore stimulendu e cellule cù PMA (20 ng/ml) è ionomicina (1 μg/ml) cù GolgiStop per 4 ore, è monitorà CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) è TNFα-fluorescein isotiocianato (FITC) (MAb11, BD). Stimulà e cellule qPCR è ChIP cù PMA (20 ng/ml) è ionomicina (1 μg/ml) per 4 ore. U surnatante ELISA hè statu raccoltu prima è dopu a stimulazione cù PMA (20 ng/ml) è ionomicina (1 μg/ml) per 4 ore.
Segui u protocolu di u fabricatore per isolà l'ARN cù u kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Aduprate QIAshredder (QIAGEN) per omogeneizà u campione. Aduprate u kit RNA à cDNA d'alta capacità (Thermo Fisher Scientific) per sintetizà l'ADN cumplementare (cDNA). Aduprate TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) per quantificà l'espressione genica (secondu u protocolu di u fabricatore) cù e seguenti sonde: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldeide-3-fosfatu off Hydrogen (GAPDH)] è Hs01010726_m1 (SLC22A2). I campioni sò stati eseguiti nantu à u sistema PCR in tempu reale StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) in a piastra di reazione ottica rapida MicroAmp à 96 pozzetti (Applied Biosystems) cù a pellicola ottica MicroAmp. Ogni valore Ct chì supera 35 hè cunsideratu sopra à a soglia di rilevazione è hè marcatu cum'è indetectabile.
Eseguite ChIP cum'è descrittu prima (58). In breve, e cellule sò state trattate cù formaldeide (cuncentrazione finale 1,42%) è incubate à temperatura ambiente per 10 minuti. Aduprate un buffer di rigonfiamentu supplementatu (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl è 0,1% NP-40) nantu à u ghjacciu per 10 minuti, poi risospendete in u buffer di immunoprecipitazione cum'è descrittu (58). U campione hè statu poi sonicatu cù i seguenti cicli: 10 cicli (20 impulsi di 1 secondu) è un tempu staticu di 40 secondi. Incubate l'immunoglobulina G di qualità ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), l'istone H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) è l'anticorpi SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) cù u campione à 4 °CC, agitate durante a notte. Incubà e perle di proteina A (Thermo Fisher Scientific) cù u campione à 4°C cù una scuzzulata delicata per 1 ora, poi aduprà perle chelex (Bio-Rad) per arricchisce u DNA, è aduprà proteinasi K (Thermo Fisher) per a digestione di e proteine. U promotore TNFα hè statu rilevatu da PCR: in avanti, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; à u cuntrariu, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produttu 207-bp). L'imagine sò state prodotte da Image Lab (Bio-Rad) è quantificate cù u software ImageJ.
U surnatante di a cultura cellulare hè statu raccoltu cum'è descrittu sopra. A determinazione hè stata effettuata secondu e procedure di u fabricatore di u kit ELISA TNFα umanu (Invitrogen), u kit ELISA IL-2 umanu (Invitrogen) è u kit ELISA IFN-γ umanu (Abcam). Sicondu u protocolu di u fabricatore, u surnatante hè statu diluitu 1:100 per rilevà TNFα è IL-2, è 1:3 per rilevà IFN-γ. Aduprate EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) per misurà l'assorbanza à 450 nm.
I PBMC sò stati separati da i prudutti di separazione di i leucociti (STEMCELL Technologies) per centrifugazione di densità di gradiente di Ficoll. E cellule CD3+ sò state isolate da i PBMC utilizendu perle CD3 (Miltenyi). In presenza o assenza di MNA, e cellule CD3+ sò state attivate cù CD3 ligatu à a piastra (5μg/ml), CD28 solubile (3μg/ml) è IL-2 (300 U/ml; Proleukin) per 3 ghjorni. Dopu à 3 ghjorni, e cellule sò state raccolte è lavate cù una soluzione salina à 0,9%, è u pellet hè statu congelatu rapidamente. U conteggio cellulare hè statu effettuatu per citometria di flussu (Cytek Aurora; cunfigurazione 3L-16V-14B-8R) utilizendu eBeads 123count.
Estrae i metaboliti cum'è descrittu sopra. L'estrattu seccu hè statu ricustituitu à una cuncentrazione di 4000 equivalenti cellulari/μl. Analizà u campione per cromatografia à fase inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) è colonna CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, dimensione di e particelle 1,6 μm, dimensione di i pori 120 Å; #186008500, Waters). Spettrometru di massa polare (6470, Agilent), in u quale a ionizazione per elettrospray funziona in modu pusitivu. A fase mobile A hè 0,1% acidu formicu (in H2O), a fase mobile B hè 90% acetonitrile, 0,1% acidu formicu. U gradiente LC hè da 0 à 2 minuti per 100% A, da 2 à 7,1 minuti per 99% B, è da 7,1 à 8 minuti per 99% B. Dopu, riequilibrate a colonna cù a fase mobile A à un flussu di 0,6 ml/min per 3 minuti. U flussu hè di 0,4 ml/min, è a camera di a colonna hè riscaldata à 50 °C. Aduprate u standard chimicu puru di MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) per stabilisce u tempu di ritenzione (RT) è a trasfurmazione (RT = 0,882 minuti, trasfurmazione 1 = 137 → 94,1, trasfurmazione 2 = 137 → 92, Cunversione 3 = 137 → 78). Quandu tutte e trè transizioni si verificanu à u tempu di ritenzione currettu, a transizione 1 hè aduprata per a quantificazione per assicurà a specificità. A curva standard di MNA (Toronto Research Chemical Company) hè stata generata da sei diluizioni seriali di a suluzione stock (1 mg/ml) per ottene standard di 0,1, 1,0, 10 è 100 ng/ml è 1,0 è 10 μg/ml rispettivamente di liquidu. U limite di rilevazione hè 1 ng/ml, è a risposta lineare hè trà 10 ng/ml è 10 μg/ml. Ogni iniezione di dui microlitri di campione è standard hè aduprata per l'analisi LC/MS, è un campione di cuntrollu di qualità mistu hè eseguitu ogni ottu iniezioni per assicurà a stabilità di a piattaforma d'analisi. E risposte MNA di tutti i campioni cellulari trattati cù MNA eranu in l'intervallu lineare di u test. L'analisi di i dati hè stata fatta aduprendu u software d'analisi quantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
A custruzzione αFR-CAR di seconda generazione hè stata presa da Song et al. (59). In breve, a custruzzione cuntene i seguenti cuntenuti: sequenza leader CD8a, frammentu variabile à catena unica specificu di αFR umanu, regione di cerniera è transmembrana CD8a, duminiu intracellulare CD27 è duminiu intracellulare CD3z. A sequenza CAR cumpleta hè stata sintetizzata da GenScript, è dopu clonata in u vettore d'espressione lentivirale di seconda generazione à monte di a cassetta d'espressione GFP aduprata per valutà l'efficienza di trasduzione.
U lentivirus hè pruduttu da a trasfezione di e cellule HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); cultivate in u mediu Eagle mudificatu da Dulbecco chì cuntene 10% di serum bovinu fetale (FBS) è 1% di PenStrep, è anu utilizatu u vettore CAR-GFP è i plasmidi di imballaggio (psPAX2 è pMD2.G, Addgene) utilizanu l'amina di lipofezione (Sigma-Aldrich). U surnatante chì cuntene u virus hè statu raccoltu 48 è 72 ore dopu a trasfezione, filtratu è cuncintratu per ultracentrifugazione. Cunservà u surnatante virale cuncintratu à -80°C finu à a trasduzione.
I PBMC sò separati da i prudutti di separazione di leucociti di donatori sani (STEMCELL Technologies) per centrifugazione di densità à gradiente di Ficoll. Aduprate microsfere CD8 di selezzione pusitiva (Miltenyi) per isolà e cellule CD8+ da i PBMC. Stimulate e cellule T cù TransAct (Miltenyi) è in u mediu TexMACS [Miltenyi; supplementatu cù 3% di serum umanu inattivatu da u calore, 1% di PenStrep è IL-2 (300 U/ml)]. Ventiquattru ore dopu a stimulazione, e cellule T sò state trasdotte cù lentivirus (10 μl di supernatante di virus cuncentratu per 106 cellule). Da 1 à 3 ghjorni dopu a trasduzione nantu à Cytek Aurora (su FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), valutate l'espressione di GFP di e cellule per dimustrà una efficienza di trasduzione di almenu 30%.
E cellule CAR-T sò state cultivate per 24 ore in Immunocult (STEMCELL Technologies; supplementatu cù 1% PenStrep) in e seguenti cundizioni: micca trattate, trattate cù 250 μM di adenosina o 10 mM di MNA. Dopu u pretrattamentu, e cellule CAR-T sò state lavate cù PBS è cumminate cù 20.000 cellule SK-OV-3 [ATCC; in u mediu McCoy 5A (Sigma-Aldrich) supplementatu cù 10% di FBS è 1% di PenStrep à 10: U rapportu effettore-bersagliu di 1 hè statu amplificatu in triplicatu in u mediu Immunocult supplementatu. E cellule SK-OV-3 è e cellule SK-OV-3 lisate cù saponina digitale (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) sò state aduprate cum'è cuntrolli negativi è pusitivi, rispettivamente. Dopu à 24 ore di co-cultura, u surnatante hè statu raccoltu è a lattato deidrogenasi (LDH) hè stata misurata secondu l'istruzzioni di u fabricatore (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). U surnatante LDH hè statu diluitu 1:50 in buffer LDH. A percentuale di uccisione hè stata misurata aduprendu a seguente formula: percentuale di uccisione = percentuale di currezzione / tasso massimu di uccisione x 100%, induve percentuale di currezzione = co-cultura-solu cellule T, è tasso massimu di uccisione = cuntrollu pusitivu-cuntrollu negativu.
Cum'è discrittu in u testu o in i materiali è i metudi, aduprate GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 per l'analisi statistica. Sè parechji campioni sò raccolti da u listessu paziente (cum'è ascite è tumore), usemu un test t appaiatu o includemu u paziente cum'è un effettu aleatoriu in un mudellu lineare o generalizatu, secondu u casu. Per l'analisi metabolomica, u test d'impurtanza hè realizatu in triplicatu.
Per materiali supplementari per questu articulu, per piacè vede http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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L'MNA cuntribuisce à a soppressione immune di e cellule T è rapprisenta un potenziale bersagliu d'immunoterapia per u trattamentu di u cancru umanu.
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