L'acidu propionicu (PPA), un agente antifunginu è un additivu dieteticu cumunu, hè statu dimustratu di causà un neurosviluppu anormale in i topi accumpagnatu da disfunzioni gastrointestinali, chì ponu esse causate da disbiosi intestinale. Hè statu suggeritu un ligame trà l'esposizione dietetica à u PPA è a disbiosi di a microbiota intestinale, ma ùn hè statu investigatu direttamente. Quì, avemu investigatu i cambiamenti assuciati à u PPA in a cumpusizione di a microbiota intestinale chì ponu purtà à a disbiosi. I microbiomi intestinali di topi alimentati cù una dieta micca trattata (n = 9) è una dieta arricchita di PPA (n = 13) sò stati sequenziati utilizendu u sequenziamentu metagenomicu à longu andà per valutà e differenze in a cumpusizione microbica è e vie metaboliche batteriche. U PPA dieteticu hè statu assuciatu à un aumentu di l'abbundanza di taxa significativi, cumprese parechje spezie di Bacteroides, Prevotella è Ruminococcus, membri di e quali sò stati precedentemente implicati in a produzzione di PPA. I microbiomi di i topi esposti à u PPA avianu ancu più vie relative à u metabolismu di i lipidi è a biosintesi di l'ormoni steroidei. I nostri risultati indicanu chì u PPA pò alterà a microbiota intestinale è e so vie metaboliche assuciate. Questi cambiamenti osservati mettenu in risaltu chì i cunservanti classificati cum'è sicuri per u cunsumu ponu influenzà a cumpusizione di a microbiota intestinale è, à u so tornu, a salute umana. Trà elli, P, G o S hè sceltu secondu u livellu di classificazione chì hè analizatu. Per minimizà l'impattu di e classificazioni falsi pusitivi, hè stata aduttata una soglia minima di abbundanza relativa di 1e-4 (1/10.000 letture). Prima di l'analisi statistica, l'abbundanze relative riportate da Bracken (fraction_total_reads) sò state trasformate utilizendu a trasfurmazione di u rapportu logaritmicu centratu (CLR) (Aitchison, 1982). U metudu CLR hè statu sceltu per a trasfurmazione di i dati perchè hè invariante in scala è sufficiente per i datasets micca sparsi (Gloor et al., 2017). A trasfurmazione CLR utilizza u logaritmu naturale. I dati di conteggio riportati da Bracken sò stati nurmalizati utilizendu l'espressione logaritmica relativa (RLE) (Anders è Huber, 2010). E figure sò state generate utilizendu una cumbinazione di matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 è logaritmi sequenziali (Gloor et al., 2017). 0.12.2 è stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). U rapportu Bacillus/Bacteroidetes hè statu calculatu per ogni campione utilizendu conteggi batterici nurmalizzati. I valori riportati in e tabelle sò arrotondati à 4 decimali. L'indice di diversità Simpson hè statu calculatu utilizendu u script alpha_diversity.py furnitu in u pacchettu KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). U rapportu Bracken hè furnitu in u script è l'indice Simpson "Si" hè furnitu per u parametru -an. Differenze significative in abbundanza sò state definite cum'è differenze medie CLR ≥ 1 o ≤ -1. Una differenza media CLR di ± 1 indica un aumentu di 2,7 volte in l'abbundanza di un tipu di campione. U segnu (+/-) indica se u taxon hè più abbundante in u campione PPA è in u campione di cuntrollu, rispettivamente. A significatività hè stata determinata cù u test Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini è Hochberg, 1995; Seabold è Perktold, 2010) hè statu utilizatu, è a prucedura di Benjamini-Hochberg hè stata applicata per curregge i testi multipli. Un valore p aghjustatu ≤ 0.05 hè statu utilizatu cum'è soglia per determinà a significatività statistica.
U microbioma umanu hè spessu chjamatu "l'ultimu organu di u corpu" è ghjoca un rolu vitale in a salute umana (Baquero è Nombela, 2012). In particulare, u microbioma intestinale hè ricunnisciutu per a so influenza à livellu di sistema è u so rolu in parechje funzioni essenziali. I batteri cummensali sò abbundanti in l'intestinu, occupendu parechje nicchie ecologiche, utilizendu nutrienti è cumpete cù potenziali patogeni (Jandhyala et al., 2015). Diversi cumpunenti batterichi di a microbiota intestinale sò capaci di pruduce nutrienti essenziali cum'è vitamine è di prumove a digestione (Rowland et al., 2018). Hè statu ancu dimustratu chì i metaboliti batterichi influenzanu u sviluppu di i tessuti è migliuranu e vie metaboliche è immunitarie (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). A cumpusizione di u microbioma intestinale umanu hè estremamente diversa è dipende da fattori genetichi è ambientali cum'è a dieta, u sessu, i medicamenti è u statu di salute (Kumbhare et al., 2019).
A dieta materna hè una cumpunente critica di u sviluppu fetale è neonatale è una fonte putativa di cumposti chì ponu influenzà u sviluppu (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Unu di questi cumposti d'interessu hè l'acidu propionicu (PPA), un sottoproduttu di acidi grassi à catena corta ottenutu da a fermentazione batterica è un additivu alimentariu (den Besten et al., 2013). U PPA hà proprietà antibatteriche è antifungine è hè dunque adupratu cum'è cunservante alimentariu è in applicazioni industriali per inibisce a crescita di muffe è batteri (Wemmenhove et al., 2016). U PPA hà effetti diversi in diversi tessuti. In u fegatu, u PPA hà effetti antiinflamatori affettendu l'espressione di citochine in i macrofagi (Kawasoe et al., 2022). Questu effettu regulatoriu hè statu osservatu ancu in altre cellule immunitarie, purtendu à una diminuzione di l'inflammazione (Haase et al., 2021). Tuttavia, l'effettu oppostu hè statu osservatu in u cervellu. Studi precedenti anu dimustratu chì l'esposizione à u PPA induce un cumpurtamentu simile à l'autismu in i topi (El-Ansary et al., 2012). Altri studii anu dimustratu chì u PPA pò induce a gliosi è attivà e vie pro-infiammatorie in u cervellu (Abdelli et al., 2019). Siccomu u PPA hè un acidu debule, pò diffondesi attraversu l'epiteliu intestinale in u sangue è cusì attraversà e barriere restrittive, cumprese a barriera emato-encefalica è ancu a placenta (Stinson et al., 2019), mettendu in risaltu l'impurtanza di u PPA cum'è metabolitu regulatoriu pruduttu da i batteri. Ancu s'è u rolu putenziale di u PPA cum'è fattore di risicu per l'autismu hè attualmente sottu investigazione, i so effetti nantu à l'individui cun autismu puderanu estendesi oltre l'induzione di a differenziazione neurale.
I sintomi gastrointestinali cum'è a diarrea è a stitichezza sò cumuni in i pazienti cun disordini di u neurosviluppu (Cao et al., 2021). Studi precedenti anu dimustratu chì u microbioma di i pazienti cun disordini di u spettru autisticu (ASD) hè diversu da quellu di l'individui sani, ciò chì suggerisce a presenza di disbiosi di a microbiota intestinale (Finegold et al., 2010). In listessu modu, e caratteristiche di u microbioma di i pazienti cun malatie infiammatorie intestinali, obesità, malatia d'Alzheimer, ecc. sò ancu diverse da quelle di l'individui sani (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Tuttavia, finu à oghje, ùn hè stata stabilita alcuna relazione causale trà u microbioma intestinale è e malatie o sintomi neurologichi (Yap et al., 2021), ancu s'è si pensa chì parechje spezie batteriche ghjucanu un rolu in alcuni di questi stati di malattia. Per esempiu, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio è altri generi sò più abbundanti in a microbiota di i pazienti cun autismu (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). In particulare, e spezie membri di alcuni di sti generi sò cunnisciute per pussede geni assuciati à a pruduzzione di PPA (Reichardt et al., 2014; Yun è Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur è Dürre, 2023). Date e proprietà antimicrobiche di u PPA, aumentà a so abbundanza pò esse beneficu per a crescita di batteri chì producenu PPA (Jacobson et al., 2018). Cusì, un ambiente riccu di PFA pò purtà à cambiamenti in a microbiota intestinale, cumpresi i patogeni gastrointestinali, chì ponu esse fattori putenziali chì portanu à sintomi gastrointestinali.
Una quistione cintrali in a ricerca di u microbioma hè di sapè s'è e differenze in a cumpusizione microbica sò una causa o un sintomu di e malatie sottostanti. U primu passu per elucidà a relazione cumplessa trà a dieta, u microbioma intestinale è e malatie neurologiche hè di valutà l'effetti di a dieta nantu à a cumpusizione microbica. À questu scopu, avemu utilizatu u sequenziamentu metagenomicu à longa lettura per paragunà i microbiomi intestinali di a discendenza di topi alimentati cù una dieta ricca di PPA o povera di PPA. A discendenza hè stata alimentata cù a listessa dieta chè e so mamme. Avemu ipotizzatu chì una dieta ricca di PPA averebbe purtatu à cambiamenti in a cumpusizione microbica intestinale è in e vie funziunali microbiche, in particulare quelle relative à u metabolismu di u PPA è/o a pruduzzione di PPA.
Stu studiu hà utilizatu topi transgenici FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) chì sovraesprimenu a proteina fluorescente verde (GFP) sottu u cuntrollu di u promotore GFAP specificu di a glia seguendu e linee guida di u Cumitatu Istituzionale per a Cura è l'Usu di l'Animali di l'Università di Florida Centrale (UCF-IACUC) (Numeru di Permessu d'Usu di l'Animali: PROTO202000002). Dopu u svezzamentu, i topi sò stati allughjati individualmente in gabbie cù 1-5 topi di ogni sessu per gabbia. I topi sò stati alimentati ad libitum cù una dieta di cuntrollu purificata (dieta standard aperta mudificata, 16 kcal% di grassi) o una dieta supplementata cù propionatu di sodiu (dieta standard aperta mudificata, 16 kcal% di grassi, cuntenente 5.000 ppm di propionatu di sodiu). A quantità di propionatu di sodiu utilizata era equivalente à 5.000 mg di PFA/kg di pesu tutale di l'alimentu. Questa hè a più alta cuncentrazione di PPA appruvata per l'usu cum'è cunservante alimentariu. Per preparà stu studiu, i topi parenti sò stati alimentati cù e duie diete per 4 settimane prima di l'accoppiamentu è anu cuntinuatu durante tutta a gravidanza di a diga. I topi discendenti [22 topi, 9 cuntrolli (6 masci, 3 femine) è 13 PPA (4 masci, 9 femine)] sò stati svezzati è dopu anu cuntinuatu cù a listessa dieta di e dighe per 5 mesi. I topi discendenti sò stati sacrificati à 5 mesi d'età è u so cuntenutu fecale intestinale hè statu raccoltu è inizialmente cunservatu in tubi di microcentrifuga da 1,5 ml à -20 °C è dopu trasferitu in un congelatore à -80 °C finu à chì u DNA ospite sia statu esauritu è l'acidi nucleici microbici sianu stati estratti.
U DNA di l'ospite hè statu eliminatu secondu un protocolu mudificatu (Charalampous et al., 2019). In breve, u cuntenutu fecale hè statu trasferitu in 500 µl d'InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) è cunservatu congelatu. Prucessà un massimu di 1-2 pellet fecali per estrazione. U cuntenutu fecale hè statu dopu omogeneizatu meccanicamente aduprendu un pestello di plastica in u tubu per furmà una sospensione. Centrifugà i campioni à 10.000 RCF per 5 minuti o finu à chì i campioni sò stati pellettati, poi aspirare u surnatante è risospendere u pellet in 250 µl 1× PBS. Aggiungere 250 µl di soluzione di saponina al 4,4% (TCI, numeru di pruduttu S0019) à u campione cum'è detergente per allentà e membrane cellulari eucariotiche. I campioni sò stati mischiati delicatamente finu à ottene una consistenza liscia è incubati à temperatura ambiente per 10 minuti. Dopu, per disturbà e cellule eucariote, 350 μl d'acqua senza nucleasi sò stati aghjunti à u campione, incubati per 30 s, è dopu 12 μl di NaCl 5 M sò stati aghjunti. I campioni sò stati dopu centrifugati à 6000 RCF per 5 min. Aspirate u surnatante è risospendete u pellet in 100 μl di PBS 1X. Per rimuovere u DNA ospitante, aghjunghjite 100 μl di buffer HL-SAN (12,8568 g di NaCl, 4 ml di MgCl2 1M, 36 ml d'acqua senza nucleasi) è 10 μl d'enzima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). I campioni sò stati mischiati accuratamente pipettendu è incubati à 37 °C per 30 minuti à 800 rpm in un Eppendorf™ ThermoMixer C. Dopu l'incubazione, centrifugati à 6000 RCF per 3 minuti è lavati duie volte cù 800 µl è 1000 µl di 1X PBS. Infine, risospendere u pellet in 100 µl di 1X PBS.
U DNA battericu tutale hè statu isolatu cù u Kit di Purificazione di DNA Genomicu Monarch di New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). A prucedura operativa standard furnita cù u kit hè ligeramente mudificata. Incubà è mantene l'acqua senza nucleasi à 60 °C prima di l'operazione per l'eluzione finale. Aghjunghje 10 µl di Proteinasi K è 3 µl di RNasi A à ogni campione. Dopu aghjunghje 100 µl di Tampone di Lisi Cellulare è mischjà delicatamente. I campioni sò stati dopu incubati in un Eppendorf™ ThermoMixer C à 56 °C è 1400 rpm per almenu 1 ora è finu à 3 ore. I campioni incubati sò stati centrifugati à 12.000 RCF per 3 minuti è u surnatante di ogni campione hè statu trasferitu in una provetta di microcentrifuga separata da 1,5 mL chì cuntene 400 µL di soluzione legante. I tubi sò stati dopu vortexati à impulsi per 5-10 secondi à intervalli di 1 secondu. Trasferite tuttu u cuntenutu liquidu di ogni campione (circa 600-700 µL) in una cartuccia di filtru posta in un tubu di raccolta à flussu continuu. I tubi sò stati centrifugati à 1.000 RCF per 3 minuti per permette u ligame iniziale di u DNA è dopu centrifugati à 12.000 RCF per 1 minutu per rimuovere u liquidu residuale. A colonna di u campione hè stata trasferita in un novu tubu di raccolta è dopu lavata duie volte. Per u primu lavaggio, aghjunghjite 500 µL di tampone di lavaggio à ogni tubu. Invertite u tubu 3-5 volte è dopu centrifugate à 12.000 RCF per 1 minutu. Scartate u liquidu da u tubu di raccolta è rimettete a cartuccia di filtru in u listessu tubu di raccolta. Per u secondu lavaggio, aghjunghjite 500 µL di tampone di lavaggio à u filtru senza invertisce. I campioni sò stati centrifugati à 12.000 RCF per 1 minutu. Trasferite u filtru in un tubu LoBind® di 1,5 mL è aghjunghjite 100 µL d'acqua preriscaldata senza nucleasi. I filtri sò stati incubati à temperatura ambiente per 1 minutu è dopu centrifugati à 12.000 RCF per 1 minutu. U DNA eluitu hè statu cunservatu à -80 °C.
A cuncentrazione di DNA hè stata quantificata cù un Fluorometru Qubit™ 4.0. U DNA hè statu preparatu cù u Kit Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (Cat. No. Q33231) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. A distribuzione di a lunghezza di i frammenti di DNA hè stata misurata cù una TapeStation Aglient™ 4150 o 4200. U DNA hè statu preparatu cù i Reagenti di DNA Genomicu Agilent™ (Cat. No. 5067-5366) è Genomic DNA ScreenTape (Cat. No. 5067-5365). A preparazione di a biblioteca hè stata realizata cù u Kit di Codificazione à Barre Rapid PCR Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) (SQK-RPB004) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. U DNA hè statu sequenziatu cù un sequenziatore ONT GridION™ Mk1 cù una cella di flussu Min106D (R 9.4.1). I paràmetri di sequenziamentu eranu: chjama di basa d'alta precisione, valore q minimu di 9, cunfigurazione di u codice à barre è trim di u codice à barre. I campioni sò stati sequenziati per 72 ore, dopu à quale i dati di chjama di basa sò stati sottumessi per ulteriore trasfurmazione è analisi.
U trattamentu bioinformaticu hè statu realizatu aduprendu i metudi descritti prima (Greenman et al., 2024). I fugliali FASTQ ottenuti da u sequenziamentu sò stati divisi in cartulari per ogni campione. Prima di l'analisi bioinformatica, i dati sò stati trattati aduprendu a seguente pipeline: prima, i fugliali FASTQ di i campioni sò stati fusi in un unicu fugliale FASTQ. Dopu, e letture più corte di 1000 bp sò state filtrate aduprendu Filtlong v. 0.2.1, cù l'unicu parametru cambiatu chì hè statu -min_length 1000 (Wick, 2024). Prima di un ulteriore filtraggio, a qualità di lettura hè stata cuntrullata aduprendu NanoPlot v. 1.41.3 cù i seguenti parametri: -fastq -plots dot -N50 -o
Per a classificazione tassonomica, e letture è i contig assemblati sò stati classificati utilizendu Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Generate rapporti è fugliali di output per letture è assemblaggi, rispettivamente. Aduprate l'opzione -use-names per analizà letture è assemblaggi. L'opzioni -gzip-compressed è -paired sò specificate per i segmenti di lettura. L'abbundanza relativa di taxa in metagenomi hè stata stimata utilizendu Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Avemu prima creatu una basa di dati kmer chì cuntene 1000 basi utilizendu bracken-build cù i seguenti parametri: -d
L'annotazione di i geni è a stima di l'abbundanza relativa sò state realizate aduprendu una versione mudificata di u protocolu discrittu da Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Prima, i contigs più corti di 500 bp sò stati rimossi da tutti l'assemblaggi aduprendu SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). L'assemblaggi selezziunati sò stati poi cumminati in un pan-metagenoma. I quadri di lettura aperti (ORF) sò stati identificati aduprendu Prodigal v. 1.0.1 (una versione parallela di Prodigal v. 2.6.3) cù i seguenti parametri: -d
I geni sò stati prima raggruppati secondu l'identificatori ortologi (KO) di l'Enciclopedia di Geni è Genomi di Kyoto (KEGG) assignati da eggNOG per paragunà l'abbundanze di e vie geniche. I geni senza knockout o i geni cù knockout multipli sò stati rimossi prima di l'analisi. L'abbundanza media di ogni KO per campione hè stata poi calculata è hè stata effettuata un'analisi statistica. I geni di u metabolismu PPA sò stati definiti cum'è qualsiasi genu chì hè statu assignatu una riga ko00640 in a colonna KEGG_Pathway, chì indica un rolu in u metabolismu di u propionatu secondu KEGG. I geni identificati cum'è assuciati à a pruduzzione di PPA sò elencati in a Tabella Supplementare 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). I testi di permutazione sò stati effettuati per identificà i geni di metabolismu è di pruduzzione di PPA chì eranu significativamente più abbundanti in ogni tipu di campione. Mille permutazioni sò state effettuate per ogni genu analizatu. Un valore p di 0,05 hè statu utilizatu cum'è cutoff per determinà a significatività statistica. L'annottazioni funziunali sò state assignate à i geni individuali in un cluster basatu annantu à l'annottazioni di i geni rappresentativi in u cluster. I taxa assuciati à u metabolismu di u PPA è/o à a pruduzzione di PPA puderanu esse identificati currispundendu à l'ID di contig in i fugliali di output di Kraken2 cù i stessi ID di contig cunservati durante l'annotazione funzionale utilizendu egNOG. U test di significatività hè statu realizatu utilizendu u test U di Mann-Whitney descrittu prima. A currezzione per i test multipli hè stata realizata utilizendu a prucedura di Benjamini-Hochberg. Un valore p di ≤ 0,05 hè statu utilizatu cum'è cutoff per determinà a significatività statistica.
A diversità di u microbioma intestinale di i topi hè stata valutata aduprendu l'indice di diversità di Simpson. Nisuna differenza significativa hè stata osservata trà i campioni di cuntrollu è PPA in termini di diversità di genere è spezie (valore p per u genere: 0,18, valore p per e spezie: 0,16) (Figura 1). A cumpusizione microbica hè stata dopu paragunata aduprendu l'analisi di i cumpunenti principali (PCA). A Figura 2 mostra u raggruppamentu di i campioni per i so phyla, chì indica chì ci eranu differenze in a cumpusizione di e spezie di i microbiomi trà i campioni PPA è di cuntrollu. Questu raggruppamentu era menu pronunciatu à u livellu di genere, chì suggerisce chì u PPA affetta certi batteri (Figura Supplementare 1).
Figura 1. Diversità alfa di i generi è cumpusizione di e spezie di u microbioma intestinale di u topu. Diagrammi à scatula chì mostranu l'indici di diversità di Simpson di i generi (A) è di e spezie (B) in i campioni di PPA è di cuntrollu. A significatività hè stata determinata cù u test U di Mann-Whitney, è a currezzione multipla hè stata effettuata cù a prucedura di Benjamini-Hochberg. ns, u valore p ùn era micca significativu (p>0,05).
Figura 2. Risultati di l'analisi di i cumpunenti principali di a cumpusizione di u microbioma intestinale di u topu à u livellu di a spezia. U graficu di l'analisi di i cumpunenti principali mostra a distribuzione di i campioni trà i so primi dui cumpunenti principali. I culori indicanu u tipu di campione: i topi esposti à PPA sò viola è i topi di cuntrollu sò gialli. I cumpunenti principali 1 è 2 sò tracciati rispettivamente nantu à l'asse x è l'asse y, è sò espressi cum'è u so rapportu di varianza spiegatu.
Utilizendu i dati di conteggio trasformati da RLE, hè stata osservata una diminuzione significativa di u rapportu medianu Bacteroidetes/Bacilli in i topi di cuntrollu è PPA (cuntrollu: 9,66, PPA: 3,02; valore p = 0,0011). Questa differenza era dovuta à una maggiore abbundanza di Bacteroidetes in i topi PPA paragunatu à i cuntrolli, ancu s'è a differenza ùn era micca significativa (CLR media di cuntrollu: 5,51, CLR media PPA: 6,62; valore p = 0,054), mentre chì l'abbundanza di Bacteroidetes era simile (CLR media di cuntrollu: 7,76, CLR media PPA: 7,60; valore p = 0,18).
L'analisi di l'abbundanza di i membri tassonomichi di u microbioma intestinale hà rivelatu chì 1 phylum è 77 spezie differianu significativamente trà i campioni di PPA è di cuntrollu (Tabella Supplementare 2). L'abbundanza di 59 spezie in i campioni di PPA era significativamente più alta di quella in i campioni di cuntrollu, mentre chì l'abbundanza di solu 16 spezie in i campioni di cuntrollu era più alta di quella in i campioni di PPA (Figura 3).
Figura 3. Abbundanza differenziale di taxa in u microbioma intestinale di topi PPA è di cuntrollu. I grafici di vulcano mostranu differenze in l'abbundanza di generi (A) o spezie (B) trà i campioni PPA è di cuntrollu. I punti grigi ùn indicanu alcuna differenza significativa in l'abbundanza di taxa. I punti culurati indicanu differenze significative in abbundanza (valore p ≤ 0,05). I primi 20 taxa cù e più grandi differenze in abbundanza trà i tipi di campioni sò mostrati in rossu è turchinu chjaru (campioni di cuntrollu è PPA), rispettivamente. I punti gialli è viola eranu almenu 2,7 volte più abbundanti in i campioni di cuntrollu o PPA chè in i cuntrolli. I punti neri rapprisentanu taxa cù abbundanze significativamente diverse, cù differenze medie di CLR trà -1 è 1. I valori P sò stati calculati utilizendu u test U di Mann-Whitney è curretti per test multipli utilizendu a prucedura Benjamini-Hochberg. E differenze medie di CLR in neru indicanu differenze significative in abbundanza.
Dopu avè analizatu a cumpusizione microbica di l'intestinu, avemu realizatu una annotazione funzionale di u microbioma. Dopu avè filtratu i geni di bassa qualità, un totale di 378.355 geni unichi sò stati identificati in tutti i campioni. L'abbundanza trasfurmata di sti geni hè stata aduprata per l'analisi di i cumpunenti principali (PCA), è i risultati anu mostratu un altu gradu di raggruppamentu di i tipi di campioni basatu annantu à i so profili funziunali (Figura 4).
Figura 4. Risultati PCA utilizendu u prufilu funziunale di u microbioma intestinale di u topu. U graficu PCA mostra a distribuzione di i campioni trà i so primi dui cumpunenti principali. I culori indicanu u tipu di campione: i topi esposti à PPA sò viola è i topi di cuntrollu sò gialli. I cumpunenti principali 1 è 2 sò tracciati rispettivamente nantu à l'asse x è l'asse y, è sò espressi cum'è u so rapportu di varianza spiegatu.
Dopu avemu esaminatu l'abbundanza di knockouts KEGG in diversi tipi di campioni. Un totale di 3648 knockouts unichi sò stati identificati, di i quali 196 eranu significativamente più abbundanti in i campioni di cuntrollu è 106 eranu più abbundanti in i campioni di PPA (Figura 5). Un totale di 145 geni sò stati rilevati in i campioni di cuntrollu è 61 geni in i campioni di PPA, cù abbundanze significativamente diverse. I percorsi ligati à u metabolismu di i lipidi è di l'aminozuccheri eranu significativamente più arricchiti in i campioni di PPA (Tabella Supplementare 3). I percorsi ligati à u metabolismu di l'azotu è i sistemi di relè di u zolfu eranu significativamente più arricchiti in i campioni di cuntrollu (Tabella Supplementare 3). L'abbundanza di geni ligati à u metabolismu di l'aminozuccheri/nucleotidi (ko:K21279) è à u metabolismu di u fosfatu di inositolo (ko:K07291) era significativamente più alta in i campioni di PPA (Figura 5). I campioni di cuntrollu avianu significativamente più geni ligati à u metabolismu di u benzoatu (ko:K22270), u metabolismu di l'azotu (ko:K00368) è a glicolisi/gluconeogenesi (ko:K00131) (Figura 5).
Fig. 5. Abbundanza differenziale di KO in u microbioma intestinale di topi PPA è di cuntrollu. U graficu di u vulcanu mostra e differenze in l'abbundanza di gruppi funziunali (KO). I punti grigi indicanu KO chì a so abbundanza ùn era micca significativamente diversa trà i tipi di campioni (valore p > 0,05). I punti culurati indicanu differenze significative in abbundanza (valore p ≤ 0,05). I 20 KO cù e più grandi differenze in abbundanza trà i tipi di campioni sò mostrati in rossu è turchinu chjaru, currispundenti à i campioni di cuntrollu è PPA, rispettivamente. I punti gialli è viola indicanu KO chì eranu almenu 2,7 volte più abbundanti in i campioni di cuntrollu è PPA, rispettivamente. I punti neri indicanu KO cù abbundanze significativamente diverse, cù differenze medie di CLR trà -1 è 1. I valori P sò stati calculati utilizendu u test U di Mann-Whitney è aghjustati per paragoni multipli utilizendu a prucedura di Benjamini-Hochberg. NaN indica chì u KO ùn appartene micca à una via in KEGG. I valori medi di differenza di CLR in neru indicanu differenze significative in abbundanza. Per infurmazioni dettagliate nantu à i percorsi à i quali appartenenu i KO elencati, vede a Tabella Supplementare 3.
Trà i geni annotati, 1601 geni avianu abbundanze significativamente diverse trà i tipi di campioni (p ≤ 0,05), cù ogni genu almenu 2,7 volte più abbundante. Di questi geni, 4 geni eranu più abbundanti in i campioni di cuntrollu è 1597 geni eranu più abbundanti in i campioni di PPA. Siccome u PPA hà proprietà antimicrobiche, avemu esaminatu l'abbundanze di i geni di metabolismu è di pruduzzione di PPA trà i tipi di campioni. Trà i 1332 geni ligati à u metabolismu di PPA, 27 geni eranu significativamente più abbundanti in i campioni di cuntrollu è 12 geni eranu più abbundanti in i campioni di PPA. Trà i 223 geni ligati à a pruduzzione di PPA, 1 genu era significativamente più abbundante in i campioni di PPA. A Figura 6A dimostra ancu a più alta abbundanza di geni implicati in u metabolismu di PPA, cù una abbundanza significativamente più alta in i campioni di cuntrollu è grandi dimensioni di l'effettu, mentre chì a Figura 6B mette in risaltu i geni individuali cù una abbundanza significativamente più alta osservata in i campioni di PPA.
Fig. 6. Abbundanza differenziale di geni ligati à u PPA in u microbioma intestinale di u topu. I grafichi di vulcano mostranu e differenze in l'abbundanza di geni assuciati à u metabolismu di u PPA (A) è a pruduzzione di PPA (B). I punti grigi indicanu geni chì a so abbundanza ùn era micca significativamente diversa trà i tipi di campioni (valore p > 0,05). I punti culurati indicanu differenze significative in abbundanza (valore p ≤ 0,05). I 20 geni cù e più grande differenze in abbundanza sò mostrati in rossu è turchinu chjaru (campioni di cuntrollu è PPA), rispettivamente. L'abbundanza di punti gialli è viola era almenu 2,7 volte più grande in i campioni di cuntrollu è PPA chè in i campioni di cuntrollu. I punti neri rapprisentanu geni cù abbundanze significativamente diverse, cù differenze medie di CLR trà -1 è 1. I valori P sò stati calculati utilizendu u test U di Mann-Whitney è curretti per paragoni multipli utilizendu a prucedura di Benjamini-Hochberg. I geni currispondenu à geni rappresentativi in u catalogu di geni non ridondanti. I nomi di i geni sò custituiti da u simbulu KEGG chì denota un genu KO. E differenze medie di CLR in neru indicanu abbundanze significativamente diverse. Un trattinu (-) indica chì ùn ci hè micca simbulu per u genu in a basa di dati KEGG.
I taxa cù geni ligati à u metabolismu è/o a pruduzzione di PPA sò stati identificati currispundendu à l'identità tassonomica di i contigs cù l'ID di contig di u genu. À u livellu di u generu, 130 generi anu geni ligati à u metabolismu di PPA è 61 generi anu geni ligati à a pruduzzione di PPA (Tabella Supplementare 4). Tuttavia, nisun generu hà mostratu differenze significative in abbundanza (p > 0,05).
À u livellu di e spezie, 144 spezie batteriche sò state trovate cù geni assuciati à u metabolismu di u PPA è 68 spezie batteriche sò state trovate cù geni assuciati à a pruduzzione di PPA (Tabella Supplementare 5). Frà i metabolizatori di PPA, ottu batteri anu mostratu aumenti significativi in abbundanza trà i tipi di campioni, è tutti anu mostratu cambiamenti significativi in l'effettu (Tabella Supplementare 6). Tutti i metabolizatori di PPA identificati cù differenze significative in abbundanza eranu più abbundanti in i campioni di PPA. A classificazione à livellu di spezie hà rivelatu rapprisentanti di generi chì ùn differianu micca significativamente trà i tipi di campioni, cumprese parechje spezie di Bacteroides è Ruminococcus, è ancu Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus è Alcaligenes polymorpha. Frà i batteri chì producenu PPA, quattru batteri anu mostratu differenze significative in abbundanza trà i tipi di campioni. E spezie cù differenze significative in abbundanza includenu Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis è Ruminococcus bovis.
In questu studiu, avemu esaminatu l'effetti di l'esposizione à u PPA nantu à a microbiota intestinale di i topi. U PPA pò suscitare diverse risposte in i batteri perchè hè pruduttu da certe spezie, adupratu cum'è fonte di nutrimentu da altre spezie, o hà effetti antimicrobici. Dunque, a so aghjunta à l'ambiente intestinale via supplementazione dietetica pò avè effetti diversi secondu a tolleranza, a suscettibilità è a capacità di utilizallu cum'è fonte di nutrienti. E spezie batteriche sensibili ponu esse eliminate è rimpiazzate da quelle chì sò più resistenti à u PPA o capaci di utilizallu cum'è fonte di nutrienti, purtendu à cambiamenti in a cumpusizione di a microbiota intestinale. I nostri risultati anu rivelatu differenze significative in a cumpusizione microbica, ma nisun effettu nantu à a diversità microbica generale. L'effetti più grandi sò stati osservati à u livellu di e spezie, cù più di 70 taxa significativamente diversi in abbundanza trà i campioni di PPA è di cuntrollu (Tabella Supplementare 2). Un'ulteriore valutazione di a cumpusizione di i campioni esposti à u PPA hà rivelatu una maggiore eterogeneità di e spezie microbiche paragunate à i campioni micca esposti, suggerendu chì u PPA pò migliurà e caratteristiche di crescita batterica è limità e pupulazioni batteriche chì ponu sopravvive in ambienti ricchi di PPA. Cusì, u PPA pò induce selettivamente cambiamenti piuttostu chè causà una disrupzione generalizzata di a diversità di a microbiota intestinale.
I cunservanti alimentari cum'è u PPA anu digià dimustratu di alterà l'abbundanza di i cumpunenti di u microbioma intestinale senza affettà a diversità generale (Nagpal et al., 2021). Quì, avemu osservatu e differenze più sorprendenti trà e spezie di Bacteroidetes in u phylum Bacteroidetes (prima cunnisciutu cum'è Bacteroidetes), chì eranu significativamente arricchite in i topi esposti à u PPA. L'aumentu di l'abbundanza di spezie di Bacteroides hè assuciatu à una maggiore degradazione di u mucus, chì pò aumentà u risicu d'infezzione è prumove l'inflammazione (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Un studiu hà trovu chì i topi maschili neonati trattati cù Bacteroides fragilis anu mostratu cumpurtamenti suciali chì ricordanu u disordine di u spettru autisticu (ASD) (Carmel et al., 2023), è altri studii anu dimustratu chì e spezie di Bacteroides ponu alterà l'attività immune è purtà à una cardiomiopatia infiammatoria autoimmune (Gil-Cruz et al., 2019). E spezie chì appartenenu à i generi Ruminococcus, Prevotella è Parabacteroides sò state ancu significativamente aumentate in i topi esposti à PPA (Coretti et al., 2018). Certe spezie di Ruminococcus sò assuciate à malatie cum'è a malatia di Crohn per via di a pruduzzione di citochine proinfiammatorie (Henke et al., 2019), mentre chì e spezie di Prevotella cum'è Prevotella humani sò assuciate à malatie metaboliche cum'è l'ipertensione è a sensibilità à l'insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Infine, avemu trovu chì u rapportu trà Bacteroidetes (prima cunnisciuti cum'è Firmicutes) è Bacteroidetes era significativamente più bassu in i topi esposti à PPA chè in i topi di cuntrollu per via di una più alta abbundanza tutale di spezie di Bacteroidetes. Stu rapportu hè statu dimustratu prima cum'è un indicatore impurtante di l'omeostasi intestinale, è i disturbi in questu rapportu sò stati assuciati à diversi stati di malatia (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), cumprese e malatie infiammatorie intestinali (Stojanov et al., 2020). Cullettivamente, e spezie di u phylum Bacteroidetes parenu esse più fortemente affettate da un PPA dieteticu elevatu. Questu pò esse duvutu à una maggiore tolleranza à u PPA o à a capacità di utilizà u PPA cum'è fonte d'energia, chì hè statu dimustratu esse veru per almenu una spezia, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). In alternativa, l'esposizione materna à u PPA pò migliurà u sviluppu fetale rendendu l'intestinu di a prole di u topu più suscettibile à a culunizazione di Bacteroidetes; tuttavia, u nostru disignu di studiu ùn hà micca permessu una tale valutazione.
A valutazione di u cuntenutu metagenomicu hà rivelatu differenze significative in l'abbundanza di geni assuciati à u metabolismu è a pruduzzione di PPA, cù i topi esposti à u PPA chì mostranu una più alta abbundanza di geni rispunsevuli di a pruduzzione di PPA, mentre chì i topi micca esposti à u PPA anu mostratu una più alta abbundanza di geni rispunsevuli di u metabolismu di u PAA (Figura 6). Quessi risultati suggerenu chì l'effettu di u PPA nantu à a cumpusizione microbica ùn pò micca esse solu duvutu à u so usu, altrimenti l'abbundanza di geni assuciati à u metabolismu di u PPA duveria avè mostratu una più alta abbundanza in u microbioma intestinale di i topi esposti à u PPA. Una spiegazione hè chì u PPA media l'abbundanza batterica principalmente per via di i so effetti antimicrobici piuttostu chè per via di u so usu da i batteri cum'è nutriente. Studi precedenti anu dimustratu chì u PPA inibisce a crescita di Salmonella Typhimurium in modu dose-dipendente (Jacobson et al., 2018). L'esposizione à concentrazioni più elevate di PPA pò selezziunà batteri chì sò resistenti à e so proprietà antimicrobiche è chì ùn ponu micca esse necessariamente capaci di metabolizallu o pruducelu. Per esempiu, parechje spezie di Parabacteroides anu mostratu una abbundanza significativamente più alta in i campioni di PPA, ma ùn sò stati rilevati geni ligati à u metabolismu o a pruduzzione di PPA (Tavule Supplementari 2, 4 è 5). Inoltre, a pruduzzione di PPA cum'è sottoproduttu di fermentazione hè largamente distribuita trà diversi batteri (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Una maggiore diversità batterica pò esse a ragione di a maggiore abbundanza di geni ligati à u metabolismu di PPA in i campioni di cuntrollu (Averina et al., 2020). Inoltre, solu 27 (2,14%) di 1332 geni eranu previsti per esse geni assuciati esclusivamente à u metabolismu di PPA. Parechji geni assuciati à u metabolismu di PPA sò ancu implicati in altre vie metaboliche. Questu dimostra ancu di più chì l'abbundanza di geni implicati in u metabolismu di PPA era più alta in i campioni di cuntrollu; questi geni ponu funziunà in vie chì ùn risultanu micca in l'utilizazione o a furmazione di PPA cum'è sottoproduttu. In questu casu, solu un genu assuciatu à a generazione di PPA hà mostratu differenze significative in abbundanza trà i tipi di campioni. À u cuntrariu di i geni assuciati à u metabolismu di u PPA, i geni marcatori per a pruduzzione di PPA sò stati selezziunati perchè sò direttamente implicati in a via batterica per a pruduzzione di PPA. In i topi esposti à u PPA, tutte e spezie sò state trovate avè una abbundanza è una capacità significativamente aumentate di pruduce PPA. Questu sustene a predizione chì i PPA selezziunerianu i pruduttori di PPA è dunque prevedenu chì a capacità di pruduzzione di PPA aumenterebbe. Tuttavia, l'abbundanza di geni ùn hè micca necessariamente correlata cù l'espressione genica; cusì, ancu s'è l'abbundanza di geni assuciati à u metabolismu di u PPA hè più alta in i campioni di cuntrollu, u tassu d'espressione pò esse differente (Shi et al., 2014). Per cunfirmà a relazione trà a prevalenza di geni pruduttori di PPA è a pruduzzione di PPA, sò necessarii studii di l'espressione di geni implicati in a pruduzzione di PPA.
L'annotazione funzionale di i metagenomi PPA è di cuntrollu hà revelatu alcune differenze. L'analisi PCA di u cuntenutu geneticu hà revelatu cluster discreti trà i campioni PPA è di cuntrollu (Figura 5). U clustering in u campione hà revelatu chì u cuntenutu geneticu di cuntrollu era più diversu, mentre chì i campioni PPA si sò raggruppati inseme. U clustering per cuntenutu geneticu era paragunabile à u clustering per cumpusizione di e spezie. Cusì, e differenze in l'abbundanza di e vie sò coerenti cù i cambiamenti in l'abbundanza di spezie specifiche è ceppi in elle. In i campioni PPA, duie vie cù una abbundanza significativamente più alta eranu ligate à u metabolismu di u zuccheru aminozuccheru/nucleotide (ko:K21279) è à parechje vie di u metabolismu lipidicu (ko:K00647, ko:K03801; Tabella Supplementare 3). I geni assuciati à ko:K21279 sò cunnisciuti per esse assuciati à u generu Bacteroides, unu di i generi cù un numeru significativamente più altu di spezie in i campioni PPA. Questu enzima pò evità a risposta immune esprimendu polisaccaridi capsulari (Wang et al., 2008). Questu pò spiegà l'aumentu di Bacteroidetes osservatu in i topi esposti à PPA. Questu cumplementa l'aumentu di a sintesi di l'acidi grassi osservatu in u microbioma PPA. I batteri utilizanu a via FASIIko:K00647 (fabB) per pruduce acidi grassi, chì ponu influenzà e vie metaboliche di l'ospite (Yao è Rock, 2015; Johnson et al., 2020), è i cambiamenti in u metabolismu di i lipidi ponu ghjucà un rolu in u neurosviluppu (Yu et al., 2020). Un'altra via chì mostra una maggiore abbundanza in i campioni di PPA hè stata a biosintesi di l'ormoni steroidei (ko:K12343). Ci hè una crescente evidenza chì ci hè una relazione inversa trà a capacità di a microbiota intestinale d'influenzà i livelli ormonali è d'esse influenzata da l'ormoni, in modu chì livelli elevati di steroidi ponu avè cunsequenze per a salute à valle (Tetel et al., 2018).
Stu studiu ùn hè micca senza limitazioni è cunsiderazioni. Una distinzione impurtante hè chì ùn avemu micca realizatu valutazioni fisiologiche di l'animali. Dunque, ùn hè micca pussibule di cunclude direttamente se i cambiamenti in u microbiome sò assuciati à qualchì malatia. Un'altra cunsiderazione hè chì i topi in questu studiu sò stati alimentati cù a stessa dieta di e so mamme. Studi futuri puderanu determinà se u cambiamentu da una dieta ricca di PPA à una dieta senza PPA migliora i so effetti nantu à u microbiome. Una limitazione di u nostru studiu, cum'è parechji altri, hè a dimensione limitata di u campione. Ancu s'è si ponu trarre cunclusioni valide, una dimensione di campione più grande furnirebbe una maggiore putenza statistica quandu si analizanu i risultati. Semu ancu prudenti in quantu à trarre cunclusioni nantu à una associazione trà i cambiamenti in u microbiome intestinale è qualsiasi malatia (Yap et al., 2021). I fattori cunfundenti cumpresi l'età, u sessu è a dieta ponu influenzà significativamente a cumpusizione di i microrganismi. Quessi fattori puderanu spiegà l'inconsistenze osservate in a literatura riguardu à l'associazione di u microbiome intestinale cù malatie cumplesse (Johnson et al., 2019; Lagod è Naser, 2023). Per esempiu, hè statu dimustratu chì i membri di u genaru Bacteroidetes sò aumentati o diminuiti in l'animali è l'omu cù ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). In listessu modu, studii di a cumpusizione intestinale in i pazienti cù malatie infiammatorie intestinali anu trovu sia aumenti sia diminuzioni in i stessi taxa (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Per limità l'impattu di u pregiudiziu di genere, avemu pruvatu à assicurà una rappresentanza uguale di i sessi in modu chì e differenze eranu probabilmente guidate da a dieta. Una sfida di l'annotazione funzionale hè a rimuzione di sequenze geniche ridondanti. U nostru metudu di clustering di geni richiede una identità di sequenza di 95% è una similitudine di lunghezza di 85%, è ancu una copertura di allineamentu di 90% per eliminà i falsi clustering. Tuttavia, in certi casi, avemu osservatu COG cù e stesse annotazioni (per esempiu, MUT) (Fig. 6). Ulteriori studii sò necessarii per determinà se questi ortologhi sò distinti, assuciati à generi specifici, o se questu hè una limitazione di l'approcciu di raggruppamentu di geni. Un'altra limitazione di l'annotazione funzionale hè una potenziale classificazione errata; u genu battericu mmdA hè un enzima cunnisciutu implicatu in a sintesi di propionatu, ma KEGG ùn l'associa micca à a via metabolica di u propionatu. In cuntrastu, l'ortologhi scpB è mmcD sò correlati. U grande numeru di geni senza knockout designati pò risultà in una incapacità di identificà i geni correlati à PPA quandu si valuta l'abbundanza di geni. I studii futuri beneficeranu di l'analisi di u metatrascrittoma, chì pò furnisce una comprensione più profonda di e caratteristiche funziunali di a microbiota intestinale è ligà l'espressione genica à potenziali effetti a valle. Per i studii chì implicanu disordini neurodevelopmental specifici o malatie infiammatorie intestinali, sò necessarie valutazioni fisiologiche è comportamentali di l'animali per ligà i cambiamenti in a cumpusizione di u microbioma à questi disordini. Studi supplementari chì trapiantanu u microbioma intestinale in topi senza germi seranu ancu utili per determinà se u microbioma hè un driver o una caratteristica di a malattia.
In riassuntu, avemu dimustratu chì u PPA dieteticu agisce cum'è un fattore chì altera a cumpusizione di a microbiota intestinale. U PPA hè un cunservante appruvatu da a FDA chì si trova largamente in diversi alimenti chì, dopu una esposizione à longu andà, pò purtà à una disrupzione di a flora intestinale nurmale. Avemu trovu cambiamenti in l'abbundanza di parechji batteri, chì suggerenu chì u PPA pò influenzà a cumpusizione di a microbiota intestinale. I cambiamenti in a microbiota ponu purtà à cambiamenti in i livelli di certe vie metaboliche, chì ponu purtà à cambiamenti fisiologichi chì sò pertinenti à a salute di l'ospite. Ulteriori studii sò necessarii per determinà se l'effetti di u PPA dieteticu nantu à a cumpusizione microbica ponu purtà à disbiosi o altre malatie. Questu studiu pone e basi per studii futuri nantu à cumu l'effetti di u PPA nantu à a cumpusizione intestinale ponu influenzà a salute umana.
I datasets presentati in questu studiu sò dispunibili in repositori in linea. U nome di u repositoriu è u numeru d'accessu sò: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Stu studiu animale hè statu appruvatu da u Cumitatu Istituziunale per a Cura è l'Usu di l'Animali di l'Università di Florida Centrale (UCF-IACUC) (Numeru di Permessu d'Usu di l'Animali: PROTO202000002). Stu studiu hè cunforme à e lege, regulamenti è esigenze istituziunali lucali.
NG: Cuncettualizazione, Curazione di dati, Analisi formale, Investigazione, Metodologia, Software, Visualizazione, Scrittura (bozza originale), Scrittura (revisione è edizione). LA: Cuncettualizazione, Curazione di dati, Metodologia, Risorse, Scrittura (revisione è edizione). SH: Analisi formale, Software, Scrittura (revisione è edizione). SA: Investigazione, Scrittura (revisione è edizione). Capu di ghjudice: Investigazione, Scrittura (revisione è edizione). SN: Cuncettualizazione, Amministrazione di prughjetti, Risorse, Supervisione, Scrittura (revisione è edizione). TA: Cuncettualizazione, Amministrazione di prughjetti, Supervisione, Scrittura (revisione è edizione).
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Data di publicazione: 18 d'aprile di u 2025