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À u cuntrariu di i vertebrati, si pensa largamente chì l'insetti ùn anu micca ormoni steroidei sessuali à parè maschile. In Anopheles gambiae, u steroide ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) pare esse evolutu per cuntrullà u sviluppu di l'ova quandu hè sintetizatu da e femine2 è per induce un periodu refrattariu di l'accoppiamentu quandu hè trasferitu sessualmente da i masci3. Siccomu u sviluppu di l'ova è l'accoppiamentu sò tratti riproduttivi essenziali, capisce cumu e zanzare femine Anopheles integranu questi segnali ormonali puderia facilità a cuncepimentu di novi prugrammi di cuntrollu di a malaria. Quì, rivelemu chì queste funzioni riproduttive sò regulate da steroidi sessuali distinti attraversu una rete cumplessa di enzimi attivanti/inattivanti ecdisteroidi. Avemu identificatu un ecdysone ossidatu specificu per u maschile, 3-dehydro-20E (3D20E), chì prutege a parentela chjudendu a ricettività sessuale femminile dopu u trasferimentu sessuale è l'attivazione per defosforilazione. In particulare, u trasferimentu 3D20E hà ancu induttu l'espressione di geni riproduttivi chì mantenenu u sviluppu di l'ova durante l'infezione da Plasmodium, assicurendu a salute di e femine infettate. 20E derivatu da e femine ùn suscita micca un sessuale risposta, ma permette à l'individui in accoppiamentu di pone l'ova dopu chì e chinasi inibitrici di 20E sò state inibite. L'identificazione di questu ormone steroideo specificu per l'insettu maschile è u so rolu in a regulazione di a ricettività sessuale femminile, a fertilità è l'interazione cù u Plasmodium suggerisce u putenziale di riduce u successu riproduttivu di e zanzare trasmettenti a malaria.
I casi di malaria è i morti sò in crescita di novu4 per via di a resistenza diffusa à l'insetticidi in i zanzari Anopheles, l'unicu vettore di i parassiti di a malaria umana. A biologia di l'accoppiamentu di sti zanzari hè un bersagliu particularmente attraente per i novi interventi di cuntrollu di a malaria perchè e femine si accoppianu solu una volta5; rende questu unicu avvenimentu di accoppiamentu sterile avaria un grande putenziale per riduce e pupulazioni di zanzari in u campu.
E donne diventanu sessualmente incapaci dopu avè ricevutu ormoni steroidei à altu titulu da l'omi. Studi anu dimustratu chì u fattore scatenante per a difficultà in l'accoppiamentu ulteriore hè u 20-idrossiecdisone (20E), un ormone steroideo più cunnisciutu cum'è regulatore di u ciclu di muta in u stadiu larvale. A capacità di i masci di sintetizà è trasferisce 20E s'hè evoluta specificamente in e spezie di Anopheles chì facenu parte di u sottogenere Cellia7, chì hè distribuitu in Africa è include i vettori più periculosi di a malaria, cumpresi Anopheles gambiae. Questu hè particularmente degne di nota perchè in queste spezie e femine producenu ancu 20E dopu ogni pastu di sangue, è 20E guida u ciclu di l'oogenesi (vede rif. 8). Tuttavia, si sà pocu nantu à u modu in cui e femine integranu i segnali da duie diverse fonti di ecdisone (trasferimentu maschile è induzione di l'alimentazione di sangue) senza compromettere a so propria capacità di accoppiarsi. In fatti, se u 20E pruduttu da e femine scatena l'intolleranza sessuale, questu porterà à a sterilità in l'individui chì si nutriscenu vergini, un cumpurtamentu assai cumunu in queste zanzare5.
Una pussibile spiegazione hè chì i masci di A. gambiae trasferiscenu un ecdisone mudificatu specificu per u maschile, chì attiva una cascata di segnalazione in u trattu riproduttivu femminile, risultendu in instabilità di accoppiamentu. Tuttavia, ancu s'è i vertebrati anu parechji ormoni steroidei, cum'è l'estrogeni è l'androgeni (rivisti in a rif. 9), à a nostra cunniscenza, i steroidi à parità androgenica ùn sò stati identificati in l'insetti.
Avemu decisu di determinà u repertoriu di ormoni steroidi in a glandula accessoria maschile maschile (MAG) di A. gambiae sessualmente matura in cerca di pussibuli steroidi modificatori. Usendu a cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata cù a spettrometria di massa in tandem (HPLC-MS/MS) invece di u metudu menu specificu utilizatu prima, avemu rilevatu ecdysone (E) è 20E in questu tissutu, cunfirmendu u risultatu precedente. Tuttavia, u campione era duminatu da steroidi fosforilati ossidati, coerenti cù a formula 3-deidro-20E-22-fosfatu (3D20E22P)12 (Figura 1). Altre forme includenu 3-deidro-20E (3D20E) è 20E-22-fosfatu (20E22P). L'intensità di u signale HPLC-MS/MS di 3D20E22P era dui ordini di grandezza più alta di a so forma defosforilata, 3D20E, è trè ordini di grandezza più alta di quella di E è 20E (Figura 1). Ancu s'è in altre parti di u corpu è di a parte inferiore trattu riproduttivu (LRT; Dati Estesi Fig. 1a). Avemu ancu analizatu l'ecdisteroidi in masci è femine appena chjusi (<1 ghjornu di vita) è avemu rilevatu 3D20E è 3D20E22P solu in MAG; E, 20E è 20E22P eranu presenti in i dui sessi (Dati Estesi Fig. 1b). Questi dati suggerenu chì i masci adulti di A. gambiae producenu alti tituli di ormoni modificanti in i so MAG chì ùn sò micca sintetizzati da e femine.
MAG è LRT femminile (cumpresi atrii, vescicole seminali è parovarium) sò stati dissezionati da masci vergini di 4 ghjorni (4 ghjorni) è femine vergini è accoppiate (0,5, 3 è 12 hpm). L'ecdysone in questi tessuti hè stata analizata da HPLC-MS/MS (media ± sem; t-test non appaiato, bilaterale, currettu per u tassu di falsa scuperta (FDR); NS, micca significativu; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 ore vs. 0,5 ore, P = 0,035; 12 ore vs. 3 ore, P = 0,0015; 12 ore vs. 0,5 ore, P = 0,030. 3D20E22P: 3 ore vs. 0,5 ore, P = 0,25; 12 ore vs. 3 ore, P = 0,0032; 12 ore vs. 0,5 ore, P = 0,015). I dati sò da trè repliche biologiche. L'area di u piccu per ogni ecdysone d'interessu hè stata calculata è nurmalizzata da u numeru di zanzare. L'ecdysone hè rapprisintata da u culore cum'è seguita: E, verde; 20E, aranciu; 20E22P, viola; 3D20E, blu; 3D20E22P, rosa. L'insertu aumenta a scala nantu à l'asse y per mustrà livelli di ecdysone più bassi.
Per investigà se 3D20E22P è 3D20E sò trasferiti durante l'accoppiamentu, avemu dissezionatu LRT femine in diversi momenti dopu l'accoppiamentu. Ancu s'è l'ecdysone ùn hè stata trovata in e vergini, avemu osservatu quantità sustanziali di 3D20E22P in u LRT subitu dopu l'accoppiamentu (0,5 ore dopu l'accoppiamentu, hpm), diminuendu cù u tempu, mentre chì i livelli di 3D20E sò aumentati significativamente (Fig. 1). Usendu 3D20E sintetizatu chimicamente cum'è standard, avemu determinatu chì i livelli di questu ormone steroide in LRT d'accoppiamentu eranu almenu 100 volte più alti di 20E (Tabella di Dati Estesi 1). Cusì, 3D20E22P hè u principale ecdysone maschile chì hè trasferitu à u LRT femina durante l'accoppiamentu, è a so forma defosforilata, 3D20E, diventa assai abbundante pocu dopu l'accoppiamentu. Questu suggerisce un rolu impurtante per quest'ultima ecdysone in a biologia post-accoppiamentu femminile.
Dopu avè generatu un novu inseme di dati di sequenziamentu di l'ARN (RNA-seq) (Fig. 2a), utilizendu una pipeline bioinformatica custruita apposta, avemu cercatu l'ecdysone chinasi (EcK), l'ecdysone ossidasi (EO) è l'ecdysone chì codifica u genu di a fosfatasi mudificatu da 20E. EPP) hè espressu in i tessuti riproduttivi. Avemu identificatu un genu EPP candidatu è dui putenziali geni EcK (EcK1 è EcK2), ma ùn simu stati capaci di truvà un bon genu EO candidatu. In particulare, i geni EPP individuali sò stati espressi à livelli elevati (98,9esimu percentile) in i MAG gambiani, ma micca in i LRT femminili (Fig. 2b), contrariamente à e nostre aspettative postu chì a defosforilazione di 3D20E22P hè accaduta in questu tissutu femminile. Dunque, credemu chì l'EPP maschile pò esse trasferitu durante l'accoppiamentu. In effetti, avemu utilizatu a marcatura isotopica stabile in vivo per mascherà a proteina femminile dopu l'accoppiamentu, un enzima identificatu da MS in l'atriu femminile (Fig. 2c è Tabella Supplementare 1). U A prisenza di EPP in MAG è LRT femina accoppiata (ma micca vergine) hè stata ancu cunfirmata aduprendu anticorpi specifichi (Fig. 2d).
a, Una pipeline bioinformatica custruita apposta per circà i tessuti riproduttivi di ogni sessu per i geni chì codificanu EcK, EO è EPP. I numeri accantu à e frecce indicanu u numeru di candidati maschili è femine à ogni passu. Questa analisi hà identificatu un genu EPP (EPP) è un genu EcK (EcK1) chì sò espressi in i masci, è un genu EcK (EcK2) chì hè espressu in i dui sessi, ma ùn produce micca un genu EO candidatu. b, Mappa di calore chì paraguna l'espressione di u genu candidatu in i tessuti vergini (V) è in accoppiamentu (M) di Anopheles gambiae è Anopheles albicans. Spca, fecundazione; MAG, ghiandole accessorie in i masci; altre parti di u corpu, cumpresi i petti, l'ale, e gambe, i corpi grassi è l'organi interni in i dui sessi, è l'ovaie in e femine. EcK2 hè assai espressu sia in MAG sia in l'atrii di Gambia, mentre chì EPP si trova solu in MAG. c, Analisi proteomica di a traslocazione di u gruppu di l'eiaculatu maschile in l'atrii femminili à 3, 12 è 24 hpm, chì mostra e 67 proteine ​​più abbundanti. E femine sò state allevate cù una dieta chì cuntene 15N per etichettà (è mascherà) tutte e proteine. I masci senza etichetta sò stati accoppiati cù femine marcate, è e LRT femminili sò state dissezionate à 3, 12 è 24 hpm per l'analisi proteomica (vede a Tabella Supplementare 1 per una lista cumpleta di e proteine ​​eiaculatorie). Insertu, EPP, Eck1 è EcK2 sò stati rilevati in u MAG di i masci vergini per analisi proteomica di questi tessuti. d, EPP hè statu rilevatu per western blot in MAG è LRT di e femine accoppiate, ma micca in e femine o i masci vergini o u restu di a femina corpu. E membrane sò state sondate simultaneamente cù anticorpi anti-actina (cuntrollu di carica) è anticorpi anti-EPP. Tutti i masci sò vergini. Vede a Figura Supplementare 1 per i dati di a fonte di u gel. I Western blots sò stati realizati duie volte cù risultati simili.
L'attività di fosfofosfatasi ecdisteroide di EPP hè stata verificata dopu l'incubazione da HPLC-MS/MS cù 3D20E22P isolatu da MAG (Dati Estesi Fig. 2a). Inoltre, quandu avemu silenziatu EPP per interferenza mediata da RNA (RNAi), avemu rilevatu una forte riduzione di l'attività di fosfatasi in i tessuti riproduttivi di questi masci (Fig. 3a), è e femine accoppiate cù masci silenziati da EPP anu mostratu una proporzione significativamente più bassa di 3D20E defosforilatu (Fig. 3b) malgradu u silenziamentu geneticu parziale (Dati Estesi Fig. 2b,c). In cuntrastu, ùn avemu micca rilevatu cambiamenti significativi in ​​u rapportu 20E22P/20E in e stesse zanzare, ciò chì puderia suggerisce chì l'enzima hè specificu per 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Diminuzione di l'attività di a fosfatasi in MAG causata da u silenziamentu EPP utilizendu cuntrolli di RNA EPP à doppia catena (dsEPP) o RNA GFP à doppia catena (dsGFP). Venti gruppi MAG sò stati utilizati in ogni replica (P = 0,0046, test t appaiatu, bilaterale), rapprisentati da punti separati. b, E femine accoppiate cù masci silenziati EPP avianu una proporzione significativamente più bassa di 3D20E defosforilatu à 3 hpm (P = 0,0043, test t non appaiatu, bilaterale), mentre chì i livelli di 20E ùn sò stati affettati (P ​​= 0,063, non appaiatu). t-test, bilaterale). I dati sò presentati cum'è media ± sem da trè gruppi di 13, 16 è 19 femine ognunu.c, E femine accoppiate cù masci silenziati da EPP avianu tassi significativamente più alti di riaccoppiamentu (P = 0,0002, test esattu di Fisher, bilaterale). E femine sò state prima furzate à accoppiassi per assicurà u so statutu d'accoppiamentu; 2 ghjorni dopu, sò stati cuntattati cù altri masci chì purtavanu sperma transgenicu per valutà i tassi di riaccoppiamentu per mezu di a rilevazione PCR quantitativa di u transgene.d, E femine alimentate cù sangue accoppiate cù masci silenziati cù EPP avianu una fertilità significativamente ridutta (P < 0,0001; test di Mann-Whitney, bilaterale) è un numeru d'ova ligeramente riduttu (P = 0,088, test di Mann-Whitney, bilaterale), mentre chì u tassu di riproduzione ùn era micca affettatu (P = 0,94, test esattu di Fisher, bilaterale). In tutti i pannelli, n rapprisenta u numeru di campioni di zanzare biologicamente indipendenti.NS, micca significativu.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Dopu, avemu valutatu se a defosforilazione di l'ecdisone hè impurtante per induce a resistenza à l'accoppiamentu in e femine. In particulare, e femine accoppiate cù masci depleti di EPP si sò accoppiate di novu à una frequenza assai più alta (44,9%) chè e femine di cuntrollu (10,4%) quandu sò state esposte à altri masci (transgenici) (Fig. 3c). Avemu ancu osservatu una diminuzione significativa di a fertilità (Fig. 3d, sinistra) è una ligera diminuzione di u numeru di ova deposte da queste femine (Fig. 3d, centru), mentre chì a percentuale di ova deposte da e femine (un'altra risposta suscitata in e femine da l'accoppiamentu)) ùn hè stata affettata (Fig. 3d, diritta). Data a specificità osservata di EPP per 3D20E22P, questi risultati suggerenu chì l'attivazione di 3D20E da EPP trasferitu durante l'accoppiamentu pò avè un rolu impurtante in a disattivazione di a ricettività femminile à ulteriori accoppiamenti, un cumpurtamentu precedentemente attribuitu à u trasferimentu sessuale di 20E. Dunque, questu ormone specificu per u maschile influenza ancu fortemente a fertilità femminile.
Dopu, avemu paragunatu l'attività di 20E è 3D20E in esperimenti d'iniezione in vergini sessualmente mature utilizendu 3D20E sintetizatu chimicamente (Fig. 4a-c) è 20E dispunibule cummercialmente. Avemu osservatu chì 3D20E era significativamente più efficace chè 20E in a chiusura di a sensibilità femminile à l'accoppiamentu à entrambe e concentrazioni (Fig. 4d). In particulare, a metà di u livellu fisiologicu di 3D20E in u LRT (1.066 pg dopu l'iniezione vs. 2.022 pg dopu l'accoppiamentu) hà induttu una proporzione di femine refrattarie chì era 20 volte più alta di u livellu fisiologicu di 20E (361 pg dopu l'iniezione) 24 ore dopu l'iniezione à a più alta concentrazione 18 pg dopu l'accoppiamentu; Tabella di Dati Estesi 1). Stu risultatu hè coerente cù l'idea chì u trasferimentu sessuale di 20E ùn provoca micca periodi refrattarii di l'accoppiamentu, è indica ancu 3D20E cum'è un fattore maiò per assicurà a relazione genitore-figliolu. 3D20E era ancu significativamente più attivu di 20E in i testi di deposizione di l'ova in femine vergini (Fig. 4e), ciò chì suggerisce chì u tassu nurmale di deposizione di l'ova chì avemu osservatu dopu u silenziamentu parziale di l'EPP era duvutu à a presenza di l'attività residuale di 3D20E sempre prodotta da fattori femminili indotti da l'accoppiamentu.
(a,b) 3D20E sintetizatu chimicamente da 20E (a) cù una cunversione/efficienza assai alta (dati presentati cum'è media ± sem da trè reazioni di sintesi indipendenti) (b).c, Spettru di massa (metà inferiore) currisponde esattamente à l'ecdisone truvata in LRT femminile accoppiata (metà superiore).d, Paragunatu cù 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; test esattu di Fisher, bilaterale) è etanolu à 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; test esattu di Fisher, bilaterale), mentre chì 20E era significativamente più altu ch'è u cuntrollu solu à dosi più alte (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; test esattu di Fisher, bilaterale).e, 3D20E L'iniezione hà induttu tassi di ripruduzzione significativamente più alti in e femine vergini cà i cuntrolli cù etanolu à 10% (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; test esattu di Fisher, bilaterale), mentre chì 20E paragunatu à i cuntrolli solu à dosi più alte (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; test esattu di Fisher, bilaterale). 3D20E hà induttu tassi di ripruduzzione significativamente più alti cà 20E à dosi più alte (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; test esattu di Fisher, bilaterale). In tutti i pannelli, n rapprisenta u numeru di campioni di zanzare biologicamente indipendenti. NS, micca significativu. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0.001. I dati sò da trè repliche.
In studii precedenti, avemu determinatu chì u trasferimentu sessuale di ormoni steroidei induce l'espressione di MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), un genu riproduttivu femminile chì prutege e femine di A. gambiae da l'infezzione da P. falciparum Costi sanitari causati da 13, u parassita di a malaria umana più mortale. Data l'impurtanza di MISO per a fitness riproduttiva di Anopheles in e zone endemiche di malaria, avemu decisu di determinà quale ormone 3D20E o 20E attiva l'espressione di questu genu. Avemu trovu chì mentre l'iniezione di 20E induce specificamente o più potentemente alcuni recettori di ormoni nucleari (HR), cum'è HR3 è HR4, è tipici bersagli steroidei a valle, cum'è i geni yolkogenici Vg14, 15, 16, MISO era più fortemente induttu da 3D20E (Dati estesi Fig. 3). Cusì, u trasferimentu sessuale di questu ormone steroideo androgenicu pare induce meccanismi chì pruteggenu e femine da i costi posti da l'infezzione parassitaria. Inoltre, 3D20E affetta in modu differenziale tramindui isoformi di u receptore E EcR, chì inducenu EcR-A è riprimenu EcR-B, è scatenanu più forte altri geni chì inducenu l'accoppiamentu, cumprese HPX15, chì affetta a fertilità femminile. Questu puderia spiegà a significativa infertilità osservata in e femine accoppiate cù masci silenziati da EPP (Dati Estesi Fig. 3). Questi dati suggerenu l'esistenza di vie a valle attivate preferenzialmente da dui ormoni ecdisone chì puderanu esse à a basa di a funzione specifica di u sessu.
Dopu, avemu testatu a funzione di i dui geni EcK identificati in a nostra pipeline bioinformatica. U silenziamentu di EcK1 o EcK2 hà risultatu in una mortalità significativa in i masci (Dati Estesi Fig. 4a), chì suggerisce chì a fosforilazione di l'ecdisone, è dunque l'inattivazione, hè impurtante per a sopravvivenza. Siccomu EcK2 hè statu espressu à livelli più alti di EcK1 è hè statu rilevatu in MAG da a proteomica (Fig. 2b,c è Tabella Supplementare 2), avemu validatu a so attività di chinasi ecdisteroide incubendula cù 20E, chì hà risultatu in a fosforilazione di 20E22P (Dati Estesi Figura 2).4b). Quandu si usa 3D20E cum'è substratu, ùn simu stati capaci di rilevà u pruduttu fosforilatu 3D20E22P (Dati Estesi Fig. 4c), chì suggerisce chì 20E piuttostu chè 3D20E pò esse u bersagliu preferitu di EcK2.
Sicondu a nostra analisi RNA-seq, EcK2 era ancu assai espressu in a LRT di e femine vergini, induve hè statu disattivatu dopu l'accoppiamentu (Fig. 2b). Avemu cunfirmatu questi dati è determinatu chì l'espressione di EcK2 ùn era micca affettata da l'alimentazione di sangue (Dati Estesi Fig. 5a). Estendendu i nostri esperimenti MS iniziali, avemu determinatu chì u piccu di 20E22P era strettamente ligatu à u piccu di 20E (22-26 ore dopu u pastu di sangue; Dati Estesi Fig. 5b). U silenziamentu di EcK2 in e femine vergini hà risultatu in un aumentu di 3 volte in u rapportu relativu di 20E à 20E22P à 26 ore dopu u pastu di sangue (Figure di Dati Estesi 2c è 5c), cunfirmendu chì EcK2 fosforila ancu 20E in e femine. In particulare, e vergini deplete di EcK2 anu mantenutu una piena ricettività sessuale (Dati Estesi Fig. 5d,e), suggerendu ancu chì a pruduzzione femminile di 20E ùn induce micca periodi refrattari di accoppiamentu. Tuttavia, queste femine avianu anu aumentatu significativamente i tassi di deposizione di l'ova paragunatu à i cuntrolli, cù più di u 30% di e vergini chì deponenu l'ova (Dati Estesi Fig. 5f). Sè l'iniezioni di RNA Eck2 à doppia catena (dsEcK2) sò state realizate dopu l'alimentazione di sangue, a deposizione di l'ova ùn si hè verificata, à quellu puntu u piccu 20E per via di l'ingestione di sangue era diminuitu. In generale, questi risultati sustenenu un mudellu chì 20E pruduttu dopu a succhiata di sangue pò induce a deposizione di l'ova, ma solu quandu u bloccu di deposizione di l'ova (EcK2 è forse altri fattori) hè disattivatu da l'accoppiamentu. Né l'iniezioni di 20E né quelle di 3D20E anu inibitu l'espressione di EcK2 in e vergini (Dati Estesi Fig. 5g), suggerendu chì altri fattori medianu l'inibizione di sta chinasi. Tuttavia, i livelli di 20E dopu l'alimentazione di sangue ùn eranu micca sufficienti per induce discomfort di accoppiamentu, ma sò stati effettivamente scatenati da alti tituli di 3D20E trasferiti sessualmente.
I nostri risultati furniscenu insights impurtanti nantu à i miccanismi chì regulanu u successu riproduttivu di A. gambiae. Hè emersu un mudellu induve i masci si sò evoluti per sintetizà alti tituli di 3D20E, un ecdysone mudificatu specificu per u maschile chì assicura a parentela desensibilizendu e femine à un ulteriore accoppiamentu. À u listessu tempu, questi vettori di malaria anu ancu evolutu un sistema efficiente per attivà 3D20E in e femine in risposta à u trasferimentu sessuale di EPP specificu per u maschile. À a nostra cunniscenza, questu hè u primu esempiu di un sistema di ormoni steroidi duminatu da u maschile è da a femina chì svolge una funzione unica è critica in l'insetti. A funzione di l'ecdysone specifica per u maschile hè stata postulata ma micca dimustrata definitivamente. Per esempiu, una ipotesi largamente smentita 18 hè chì queste funzioni possinu esse realizate da u precursore 20E E1. Hè ben cunnisciutu chì in Drosophila, a monandria hè scatenata da u trasferimentu sessuale di picculi peptidi sessuali 19,20 chì interagiscenu cù i neuroni chì innervanu u trattu riproduttivu femminile attraversu specifici recettori di peptidi sessuali 21,22. Ulteriori travagli sò necessarii per determinà e cascate di segnalazione a valle. cuntrullatu da 3D20E in e femine di A. gambiae è per determinà se queste cascate ponu esse cunservate trà e zanzare è a Drosophila.
Datu u rolu impurtante di 3D20E nantu à a fertilità è u cumpurtamentu femminile identificatu in u nostru studiu, e vie chì portanu à a sintesi è l'attivazione di 3D20E offrenu nuove opportunità per e future strategie di cuntrollu di e zanzare, cum'è a generazione di maschi sterili cumpetitivi in ​​strategie di tecnulugia di insetti sterili Aduprate per a liberazione salvatica o per imità u 3D20E in u ghjocu vergine. A funzione specifica di u maschile di 3D20E pò esse evoluta quandu A. gambiae è altre spezie di Cellia anu acquistatu a capacità di coagulà u so sperma in tappi di accoppiamentu, postu chì questu permette u trasferimentu efficiente di un gran numeru di ormoni è enzimi attivatori di ormoni. À u so tornu, l'evoluzione di 3D20E chì implementa a monandria furnisce un mecanismu per e femine (attraversu l'alta espressione di MISO) per favurisce a so fitness riproduttiva in zone di alta prevalenza di malaria, chì cuntribuisce indirettamente à a trasmissione di Plasmodium. Datu chì hè statu dimustratu chì 20E femminile hà effetti prufondi nantu à a sopravvivenza è a crescita di P. falciparum in e zanzare Anopheles femine,24 e vie di l'ormoni steroidi maschili è femine sò avà aspetti chjave di l'interazzione zanzara-parassita.
I ceppi G3 di A. gambiae sò stati allevati in cundizioni standard d'insetti (26-28 °C, umidità relativa 65-80%, fotoperiodu luce/scurità 12:12 h). E larve sò state alimentate cù alimentu in polvere per pesci (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets è Tetra Pond Sticks in un rapportu di 7:7:2). E zanzare adulte sò state alimentate ad libitum cù una soluzione di destrosio à u 10% è sangue umanu settimanale (studià i cumpunenti di u sangue). E zanzare vergini sò state ottenute segregendu i sessi à u stadiu pupale dopu avè esaminatu l'estremità per microscopia. I maschi chì portavanu u transgene DsRed sò stati descritti prima.
L'esperimenti d'accoppiamentu furzatu sò stati realizati secondu i protocolli descritti prima. Per l'accoppiamentu naturale, e femine vergini di 4 ghjorni sò state tenute in un rapportu 1:3 cù i masci vergini sessualmente maturi per duie notti. Per l'esperimenti in i quali i masci sò stati iniettati cù dsEPP, a co-gabbia hà cuincisu cù i ghjorni 3-4 dopu l'iniezione, quandu l'attività di a fosfatasi hè stata massimamente silenziata (Dati Estesi Fig. 2b).
I tessuti di zanzara, i cadaveri rimanenti (restu di u corpu), o u corpu interu sò stati dissezionati in metanolu à 100% è omogeneizzati cù una perla (perle di vetru di 2 mm, 2.400 rpm, 90 sec). E quantità di tessuti è i volumi di metanolu eranu i seguenti: restu di u corpu, 50 in 1.000 µl; MAG, 50-100 80 µl; LRT femminile, 25-50 80 µl. U precipitatu hè statu sottumessu à una seconda estrazione di metanolu cù u listessu vulume di metanolu. I detriti cellulari sò stati rimossi per centrifugazione. U metanolu da entrambe l'estrazioni hè statu cumminatu è seccu sottu flussu d'azotu, poi risospesu in i seguenti volumi di metanolu à 80% in acqua: restu di u corpu, 50 µl; MAG è LRT femminile, 30 µl.
I campioni sò stati analizati nantu à un spettrometru di massa (ID-X, Thermo Fisher) accoppiatu à un strumentu LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl di campione sò stati iniettati nantu à una colonna di 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantenuta à 25 °C. E fasi mobili per l'LC eranu A (acqua, 0,1% acidu formicu) è B (acetonitrile, 0,1% acidu formicu). U gradiente LC era u seguente: 5% B per 1 minutu, poi aumentatu à 100% B in 11 minuti. Dopu à 8 minuti à 100%, riequilibrà a colonna à 5% B per 4 minuti. A velocità di flussu era di 0,3 ml min-1. L'ionizazione in a fonte MS hè ottenuta per ionizazione elettrospray riscaldata in modi pusitivi è negativi.
U spettrometru di massa misura i dati in a gamma m/z da 350 à 680 à una risoluzione di 60.000 in modalità MS cumpleta. I dati MS/MS sò stati acquistati nantu à [M + H]+ (tutti i bersagli), [M - H2O + H]+ (tutti i bersagli) è [M - H]- (bersagli fosforilati). I dati MS/MS sò stati utilizati per cunfirmà e proprietà di l'ecdisone di i bersagli per i quali ùn era dispunibule alcun standard. Per identificà l'ecdisteroidi micca mirati, sò stati analizati i dati MS/MS per tutti i picchi HPLC cù una abbundanza relativa >15%. Quantificà utilizendu curve standard create da standard puri (20E, 3D20E) per calculà quantità assolute o diluizioni di un campione specificu (tutti l'altri bersagli) per calculà a so equivalenza à e quantità truvate in un maschile. Per 3D20E, a quantificazione hè stata effettuata utilizendu a somma di i seguenti addotti: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. I dati sò stati estratti è quantificati cù Tracefinder (versione 4.1). I dati MS/MS sò stati analizati cù Xcalibur (versione 4.4). I spettri MS di E, 20E è 3D20E sò stati paragunati à i rispettivi standard. 3D20E22P hè statu analizatu per derivatizazione cù u reagente di Girard. 20E22P hè statu analizatu per rapportu m/z.
3D20E22P hè statu purificatu da MAG. A purificazione hè stata realizata à scala analitica utilizendu un cromatografu liquidu ultra-prestazioni (Acquity, Waters) cù un detector quadrupolare basatu annantu à a massa (QDa, Acquity, Waters) in e stesse cundizioni LC cum'è l'analisi HPLC-MS/MS. A raccolta di frazioni hè stata attivata quandu l'm/z currispundente à 3D20E22P hè statu rilevatu à u listessu tempu di ritenzione cum'è determinatu prima. A purità di i cumposti estratti hè stata poi verificata da HPLC-MS/MS cum'è descrittu sopra.
L'ARN tutale hè statu estrattu da 10-12 tessuti riproduttivi o altre parti di u corpu (senza testa) aduprendu u reagente TRI (Thermo Fisher) seguendu l'istruzzioni di u fabricatore. L'ARN hè statu trattatu cù TURBO DNase (Thermo Fisher). U cDNA hè statu sintetizatu aduprendu a trascrittasi inversa di u virus di a leucemia murina Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher) seguendu l'istruzzioni di u fabricatore. I primer per a PCR quantitativa di trascrizione inversa (RT-qPCR; Tabella di Dati Estesa 2) sò stati publicati prima24 o cuncipiti aduprendu Primer-BLAST26, cù preferenza data à prudutti di dimensione 70-150 bp è chì abbraccianu giunzioni exon-exon o primer di coppia di primer esoni separati. I campioni di cDNA da trè à quattru repliche biologiche sò state diluite quattru volte in acqua per RT-qPCR. A quantificazione hè stata effettuata in reazioni replicate di 15 µl chì cuntenenu 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primer è 5 µl di cDNA diluitu. E reazioni sò state eseguite nantu à un QuantStudio 6 Pro. U sistema PCR in tempu reale (Thermo Fisher) è i dati sò stati raccolti è analizati cù Design and Analysis (versione 2.4.3). Cum'è dimustratu in questu studiu, e quantità relative sò state nurmalizate à u genu ribosomiale RpL19 (AGAP004422), chì a so espressione ùn hè micca cambiata significativamente cù l'alimentazione di sangue 27 o l'accoppiamentu 3.
A qualità di l'ARN hè stata verificata cù un Bioanalyzer 2100 Agilent (Agilent). E biblioteche Illumina paired-end sò state preparate è eseguite à u Broad Institute di MIT è Harvard. E letture di sequenziamentu sò state allineate à u genomu di A. gambiae (ceppo PEST, versione 4.12) utilizendu HISAT2 (versione 2.0.5) cù parametri predefiniti. E letture cù punteggi di qualità di mappatura (MAPQ) <30 sò state eliminate utilizendu Samtools (versione 1.3.1). U numeru di letture mappate à i geni hè statu cuntatu utilizendu htseq-count (versione 0.9.1) cù parametri predefiniti. I conteggi di lettura nurmalizzati sò stati calculati è l'espressione genica differenziale hè stata analizzata utilizendu u pacchettu DESeq2 (versione 1.28.1) in R (versione 4.0.3).
I candidati di geni chì modificanu l'ecdysone sò stati identificati circendu prima u genomu di A. gambiae utilizendu l'algoritmu PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), utilizendu valori predefiniti Parametri cù e seguenti sequenze di proteine ​​​​di query: da Bombyx mori (N ° d'accessu NP_001038956.1), Musca domestica (N ° d'accessu XP_005182020.1, XP_005175332.1 è XP_011294434.1) è Microplitis demolitor (N ° d'accessu XP_008552646.1 è XP_008552645.1) EcK da B. mori (N ° d'accessu NP_001036900), Drosophila melanogaster (N ° d'accessu NP_651202), Apis mellifera (N° d'accessu XP_394838) è Acyrthosiphon pisum (N° d'accessu XP_001947166); è EPP da B. mori (N° d'accessu XP_001947166) NP_001177919.1 è NP_001243996.1) è EO di D. melanogaster (N° d'accessu NP_572986.1) (passu 1). Dopu, filtrate i risultati basati annantu à l'alta espressione di mRNA (>100 frammenti/kilobasi esoni per milione di letture mappate (FPKM) o >85%) in u tissutu riproduttivu (LRT femminile o MAG) in Gambia (passu 2). Per migliurà a specificità, avemu sceltu enzimi candidati chì sò ancu espressi in u tissutu riproduttivu di A. albimanus, una spezia d'anopheles chì ùn sintetizza nè trasferisce ecdysone durante l'accoppiamentu. I geni candidati sò stati filtrati in basa à a bassa espressione (<100 FPKM o <85esimu percentile) in u tissutu riproduttivu di A. albimanus (passu 3). Cum'è filtru finale (passu 4), i geni candidati devenu suddisfà almenu unu di i seguenti: (1) significativamente sovraregulati dopu l'accoppiamentu (P < 0,05) secondu l'analisi di i geni espressi in modu differenziale è (2) in i tessuti non riproduttivi (< 85% o <100 FPKM).
Avemu mudificatu i metudi descritti prima 28,29,30 per ottene a marcatura isotopica di l'organismu sanu. In breve, u Saccharomyces cerevisiae di tipu II (YSC2, Sigma) di tipu salvaticu hè statu testatu in una basa d'azotu di levitu (BD Difco, DF0335) chì cuntene (pesu/vol) 2% di glucosiu (G7528, Sigma), 1,7% senza aminoacidi è sulfatu d'ammoniu. mediu di cultura) è 5% di sulfatu d'ammoniu 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) cum'è unica fonte d'azotu. U levitu hè statu recuperatu per centrifugazione è e larve di zanzara sò state alimentate ad libitum finu à a pupazione. Supplementatu cù farina di pesce (0,5 mg per 300 larve) per prevene a mortalità di u quartu stadiu. Solu e femine sò state aduprate in esperimenti d'accoppiamentu cù maschi senza marcatura per analizà u proteoma maschile trasferitu durante l'accoppiamentu.
Femine vergini di 4-6 ghjorni cù etichetta 15N sò state furzate à accoppià si cù masci vergini senza etichetta di a listessa età. L'accoppiamentu riesciutu hè statu verificatu rilevendu tappi d'accoppiamentu sottu microscopia à epifluorescenza. À 3, 12 è 24 hpm, l'atrii di 45-55 femine accoppiate sò stati dissezionati in 50 µl di tampone bicarbonatu d'ammoniu (pH 7,8) è omogeneizzati cù un pestello. L'omogeneizatu hè statu centrifugatu è u surnatante mischiatu cù 50 µl di RapiGest à 0,1% (186001860, Waters) in bicarbonatu d'ammoniu 50 mM. U surnatante è u pellet di ogni campione sò stati congelati rapidamente nantu à ghiaccio secco è spediti durante a notte à u laburatoriu MacCoss di l'Università di Washington, induve hè stata cumpletata a preparazione di u campione per LC-MS/MS. Risuspende u pellet in 50 µl di RapiGest à 0,1% in bicarbonatu d'ammoniu 50 mM è sonicà in un bagnu d'acqua. A cuncentrazione di proteine ​​di u pellet è di u supernatante hè stata misurata da u test BCA, i campioni sò stati ridutti cù 5 mM di ditiotreitolo (DTT; Sigma), alchilati cù 15 mM di iodoacetamide (Sigma) è incubati à 37 °C (1:0 50) per 1 ora cù rapportu tripsinizazione: tripsina: substratu). RapiGest hè statu lisatu da l'aggiunta di 200 mM HCl, seguita da incubazione à 37 °C per 45 minuti è centrifugazione à 14.000 rpm per 10 minuti à 4 °C per rimuovere i detriti. I campioni sò stati lavati per estrazione in fase solida à doppia modalità (cartucce Oasis MCX, Waters) è risospesi in acidu formicu à 0,1% per una cuncentrazione finale di proteine ​​di 0,33 µg µl-1. I proteomi MAG senza marcatura sò stati analizzati in modu simile da maschi vergini. Dui repliche analitiche sò state analizzate per ogni campione. In seguitu, 1 µg di ogni hè statu analizatu aduprendu una colonna di silice fusa di 25 cm è 75 μm cù una trappola di fritta Kasil1 (PQ) di silice fusa di 4 cm imballata cù resina à fase inversa Jupiter C12 (Phenomenex) è cromatografia liquida di 180 minuti. Digesti di campioni - MS/MS hè statu eseguitu nantu à un spettrometru di massa Q-Exactive HF (Thermo Fisher) cù un sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). I dati di acquisizione relativi à i dati generati per ogni esecuzione sò stati cunvertiti in furmatu mzML utilizendu Proteowizard (versione 3.0.20287) è utilizendu Comet31 (versione 3.2) contr'à a basa di dati FASTA chì cuntene sequenze di proteine ​​da Anopheles gambiae (VectorBase versione 54), Anopheles coluzzi. Una ricerca hè stata effettuata nantu à Mali-NIH (VectorBase versione 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marzu 2021), A. gambiae RNA-seq, è traduzioni à trè frame di contaminanti umani cunnisciuti. I FDR currispondenti à a mappa di peptidi sò stati determinati utilizendu Percolator32 (versione 3.05) cù una soglia di 0,01, è i peptidi sò stati assemblati in identificazioni di proteine ​​utilizendu a parsimonia di proteine ​​in Limelight33 (versione 2.2.0). Proteina relativa L'abbundanza hè stata stimata aduprendu u fattore d'abbundanza spettrale nurmalizatu (NSAF) calculatu per ogni proteina in ogni corsa cum'è descrittu prima. NSAF relativu à ogni proteina hè statu mediatu trà campioni da duie diverse repliche biologiche. A marcatura 15N hà mascheratu cù successu u proteoma femminile, ancu s'è una piccula quantità di proteina senza marcatura puderia esse rilevata da e vergini marcate. Avemu registratu a rilevazione di a riduzione di e proteine ​​maschili (spettri 1-5) in campioni grezzi femminili solu in corse tecniche, induve i campioni grezzi sò stati eseguiti dopu à i campioni maschili / d'accoppiamentu, cum'è risultatu di u "carry over" HPLC. E proteine ​​​​occasionali truvate cum'è "contaminanti" da e vergini marcate sò elencate in a Tabella Supplementare 1.
Dui peptidi antigenichi, QTTDRVAPAPDQQQ (in l'isotipu PA) è MESDGTTPSGDSEQ (in l'isotipu PA è PB) in Genscript. I dui peptidi sò stati cumminati, poi cunjugati à a proteina trasportatrice KLH è iniettati in cunigli di Nova Zelanda. I cunigli sò stati sacrificati dopu a quarta iniezione, è l'IgG tutale hè stata isolata per purificazione per affinità. L'IgG di u cunigliu più specificu per EPP hè stata aduprata per un ulteriore western blotting.
Per i western blots, MAG (n = 10, induve n rapprisenta u numeru di campioni di zanzare biologicamente indipendenti) è LRT femminile (n = 30) da maschi vergini di 4 ghjorni è femine vergini o accoppiate forzatamente (<10 dopu l'accoppiamentu), u buffer di estrazione di proteine ​​(50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% deossicolatu di sodiu; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× cocktail di inibitori di proteasi (Roche)) hè statu aghjuntu separatamente. I campioni sò stati omogeneizzati subitu dopu a dissezione cù una perla (perle di vetru di 2 mm, 2.400 rpm, 90 sec). I detriti insolubili sò stati rimossi per centrifugazione à 20.000 g à 4 °C. E proteine ​​sò state quantificate per test di Bradford (Bio-Rad). Dopu, 20 µg di proteina MAG, 40 µg di proteina LRT è 20 µg di proteina residua in massa. sò stati denaturati è separati da 10% Bis-Tris NuPAGE utilizendu u buffer MOPS. E proteine ​​sò state trasferite à membrane di fluoruru di polivinilidene utilizendu u sistema di trasferimentu iBlot2 (Thermo Fisher). E membrane sò state lavate duie volte in 1× PBS-T (0,1% Tween-20 in PBS) è poi bluccate in buffer di bloccu Odyssey (Li-Cor) per 1 ora à 22°C. E membrane sò state agitate durante a notte à 4°C cù anticorpu primariu policlonale di cunigliu anti-EPP persunalizatu (1:700 in buffer di bloccu) è anticorpu primariu monoclonale di rattu anti-actina MAC237 (Abeam; 1:4.000). E membrane sò state lavate cù PBS-T è poi incubate cù anticorpi secundarii (asina anti-cunigliu 800CW è capra anti-rattu 680LT (Li-Cor), tramindui 1:20.000) in buffer di bloccu chì cuntene 0,01% SDS è 0,2% Tween-20 per 1 ora. ora à 22 °C. E membrane sò state lavate cù PBS-T è riprese cù un scanner Odyssey CLx. L'imagine sò state raccolte è processate in Image Studio (versione 5.2). Una banda specifica currispondente à l'isoforma EPP-RA (82 kDa) ùn hè stata rilevata.
E regioni codificanti di EPP (cum'è isoforma AGAP002463-RB chì cuntene u duminiu di l'istidina fosfatasi, ricerca di duminiu cunservatu NCBI 34) è EcK2 (AGAP002181) sò state clonate in u plasmide pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); I primer sò listati in a Tavula di Dati Estesi 2. Ottu linker GS4 (in tandem) sò stati inseriti prima di u tag 6xHis C-terminale di a custruzzione pET-21a(+)-EcK2. E proteine ​​ricombinanti sò state prodotte aduprendu a reazione di sintesi di proteine ​​E. coli senza cellule NEBExpress (New England BioLabs). E proteine ​​ricombinanti sò state purificate aduprendu colonne di spin NEBExpress Ni (New England BioLabs). A proteina di cuntrollu di a diidrofolato reduttasi (DHFR) hè stata prodotta aduprendu u mudellu di DNA da u Kit di Sintesi di Proteine ​​E. coli senza cellule NEBExpress. E proteine ​​sò state conservate in glicerolo à 50% in PBS à -20 °C per un massimu di 3 mesi.
L'attività fosfatasi di l'EPP è di l'estratti di tessuti hè stata misurata aduprendu u fosfatu di 4-nitrofenile (pNPP; Sigma-Aldrich). U buffer di reazione cuntene 25 mM Tris, 50 mM acidu aceticu, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA è 1 mM DTT. U tissutu hè statu omogeneizatu in u buffer di reazione è i detriti cellulari sò stati rimossi per centrifugazione. Iniziate a reazione aghjunghjendu enzima o estrattu di tissutu à u buffer di reazione chì cuntene 2,5 mg ml-1 pNPP. A mistura di reazione hè stata incubata à temperatura ambiente in u bughju, è a quantità di pNP cunvertita da pNPP hè stata quantificata misurendu l'assorbanza à 405 nm in diversi tempi.
Per l'attività EcK in vitro, a proteina hè stata incubata cù 0,2 mg di 20E o 3D20E in 200 µl di buffer (pH 7,5) chì cuntene 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP è 10 mM MgCl2 per 2 ore à 27 °C. A reazione hè stata fermata aghjunghjendu 800 µl di metanolu, poi raffreddata à -20 °C per 1 ora, poi centrifugata à 20.000 g per 10 minuti à 4 °C. U surnatante hè statu poi analizatu da HPLC-MS/MS. Per inattivà termicamente e proteine ​​aduprate in u gruppu di cuntrollu, e proteine ​​sò state incubate in glicerolu à 50% in PBS per 20 minuti à 95 °C.
Per l'attività EPP in vitro, a proteina hè stata incubata cù 3D20E22P (equivalente à a quantità truvata in 18 coppie di MAG, purificate da HPLC-MS/MS) in 100 µl di buffer (pH 7,5) cuntenente 25 mM Tris, 50 mM acidu aceticu, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA è 1 mM DTT per 3 ore à 27 °C. A reazione hè stata fermata aghjunghjendu 400 µl di metanolu è raffreddata à -20 °C per 1 ora, poi centrifugata à 20.000 g per 10 minuti à 4 °C. U surnatante hè statu analizatu da HPLC-MS/MS.
I frammenti PCR per EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) è EcK2 (556 bp) sò stati amplificati da cDNA preparatu da cadaveri di zanzare senza testa di sessu mistu. U frammentu PCR di u cuntrollu eGFP (495 bp) hè statu amplificatu da u pCR2.1-eGFP descrittu prima; I primer PCR sò listati in a Tabella di Dati Estesi 2. U fragmentu PCR hè statu inseritu trà i promotori T7 invertiti nantu à u plasmide pL4440. I custrutti plasmidichi sò stati recuperati da E. coli competente NEB 5-α (New England Biolabs) è verificati da u sequenziamentu di u DNA prima di l'usu (vede Dati Supplementari 1 per a sequenza di l'insertu). I primer currispondenti à u promotore T7 (Tabella di Dati Estesi 2) sò stati utilizati per amplificà l'insertu da u plasmide basatu annantu à pL4440. A dimensione di u pruduttu PCR hè stata cunfirmata da l'elettroforesi in gel d'agarosa. L'RNA duplex hè statu trascritto da mudelli PCR utilizendu u Kit di Trascrizione Megascript T7 (Thermo Fisher) è purificatu secondu l'istruzzioni di u fabricatore cù e mudificazioni descritte prima.
Per l'iniezione di dsRNA, 1.380 ng di dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) sò stati iniettati à una cuncentrazione di 10 ng nl-1 in u torace di masci o femine adulti (Nanoject III, Drummond) entro 1 ghjornu dopu l'eclosione. I livelli di knockdown di geni sò stati determinati in almenu trè repliche biologiche per estrazione di RNA, sintesi di cDNA è RT-qPCR. Per l'iniezione di ecdysone, femine vergini di 4 ghjorni o vergini di 6 ghjorni alimentate cù sangue sò state iniettate cù 0,13, 0,21 o 0,63 µg di 20E o 3D20E (Nanoject III, Drummond) à cuncentrazioni di 1,3, 2,1, rispettivamente, secondu u disignu sperimentale o 6,3 ng nl-1. Iniettate 100 nl di etanolu à 10% (vol/vol) in acqua; 100 nl di 3D20E22P in 10% etanolu (equivalente à 75% di a quantità truvata in una coppia di MAG). I zanzari sò stati assignati à casu à u gruppu d'iniezione.
Per i testi di riproduzione, e femine di 3 ghjorni sò state alimentate ad libitum cù sangue umanu. Eliminate e zanzare parzialmente alimentate o micca alimentate. Sicondu u trattamentu, e femine sò state piazzate in tazze di riproduzione separate per quattru notti almenu 48 ore dopu u pastu di sangue. L'ova sò state cuntate sottu à un stereoscopiu (Stemi 508, Zeiss); per e femine accoppiate, l'ova chì si sò schiuse in larve sò state cunsiderate fertili.
Per e prove d'accoppiamentu, e femine sò state lasciate almenu 2 ghjorni secondu u trattamentu per sviluppà resistenza à l'accoppiamentu, è i masci di tipu salvaticu di a listessa età sò stati successivamente introdutti in a stessa gabbia. Dui notti dopu, e vescicule fecondate di e femine sò state dissezionate è u DNA genomicu hè statu liberatu per congelazione-scongelamentu è sonicazione in un buffer chì cuntene 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA è 25 mM NaCl (pH 8,2). I campioni sò stati incubati cù Proteinasi K (0,86 µg µl-1) per 15 minuti à 55 °C, seguitati da 10 minuti à 95 °C. E preparazioni di DNA genomicu grezzu sò state diluite 10 volte è sottumesse à a rilevazione qPCR di e sequenze di cromosomi Y; i primer sò elencati in a Tabella di Dati Estesi 2. L'assenza di sequenza di cromosomi Y indica chì ùn ci hè micca accoppiamentu.
Per i testi di riaccoppiamentu, e femine accoppiate forzatamente sò state esaminate per a presenza di tappi di accoppiamentu per cunfirmà u statu di accoppiamentu è sò state lasciate 2 ghjorni per sviluppà a refrattarietà à l'accoppiamentu in assenza di masci, cum'è descrittu prima 36. I masci chì portavanu sperma transgenicu DsRed sò stati poi introdutti in gabbie di femine. Dui notti dopu, e vescicule fecundanti sò state dissezionate da e femine, è u DNA genomicu hè statu preparatu cum'è descrittu sopra è sottumessu à a rilevazione qPCR di u transgene DsRed; i primer sò elencati in a Tabella di Dati Estesi 2. L'assenza di u transgene DsRed hà indicatu chì ùn hè accadutu alcun riaccoppiamentu.
3D20E hè statu sintetizatu cum'è descrittu prima 37. In breve, 10 mg di 20E (Sigma-Aldrich) sò stati dissolti in 10 ml d'acqua, seguitati da l'aghjunta di 30 mg di neru di platinu (in forma di polvere, Sigma-Aldrich). Un flussu dolce di O2 hè statu continuamente gorgogliatu in a mistura di reazione, chì hè stata agitata à temperatura ambiente. Dopu à 6 ore, 30 mL di metanolu sò stati aghjunti per fermà a reazione. A mistura hè stata centrifugata per rimuovere e particelle di catalizatore. U surnatante hè statu evaporatu à seccu in vacuo à temperatura ambiente. U pruduttu di reazione seccu hè statu dissoltu in etanolu à 10% è metanolu per iniezione per l'analisi HPLC-MS/MS. U tassu di cunversione (da 20E à 3D20E) era circa 97% (Fig. 4b), è u spettru MS di u 3D20E sintetizatu currisponde à quellu truvatu in e femine accoppiate (Fig. 4c).
A legenda cuntene dettagli specifichi di i testi statistici realizati. GraphPad (versione 9.0) hè statu utilizatu per realizà u test esattu di Fisher, u test di Mantel-Cox è u test t di Student. I testi di Cochran-Mantel-Haenszel sò stati realizati utilizendu un script R persunalizatu (dispunibule à https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). A distribuzione di i dati hè stata testata per a nurmalità utilizendu u test di Shapiro-Wilk cù una soglia di significatività di 0,05. Quandu i dati anu fiascatu u test di nurmalità, hè statu realizatu u test di Mann-Whitney. I dati di sopravvivenza sò stati analizati utilizendu u test di Mantel-Cox. U pacchettu DESeq2 (versione 1.28.1) hè statu utilizatu per realizà l'analisi di l'espressione differenziale à livellu di geni RNA-seq. A barra orizzontale nantu à u graficu rapprisenta a mediana. Un valore di significatività di P = 0,05 hè statu utilizatu cum'è soglia per tutti i testi.
Per più infurmazione nantu à u disignu di u studiu, vedi u riassuntu di u Nature Research Report ligatu à questu articulu.
I dati proteomichi MS sò stati dipusitati in u ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) per mezu di u PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) cù l'identificatore di u dataset PXD032157.
U dataset di RNA-seq hè dipusitatu in a Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sottu u registru seriale GSE198665.
I dati supplementari generati è/o analizzati durante u studiu attuale ponu esse ottenuti da l'autori currispondenti nantu à una dumanda raghjonevule. Questu articulu furnisce i dati di fonte.
De Loof, A. Ecdisteroidi: Steroidi sessuali d'insetti trascurati? Maschile: Scatola Nera. Scienza di l'Insecti. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-idrossiecdisone è sviluppu ovarianu in Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).