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I granuli di Ban-Lan-Gen attenuanu a colite cronica recidivante indotta da u sulfatu di sodiu di destranu in i topi modulendu a microbiota intestinale è restaurendu a pruduzzione intestinale di SCFA Derived-GLP-1
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Università di Pechino, Ospedale di Shenzhen, Dipartimentu di Farmacia, Shenzhen, Repubblica Pupulare Cinese; 2Centru di Scienze Sanitarie di l'Università di Shenzhen, Scola di Farmacia, Shenzhen, Repubblica Pupulare Cinese; 3Università Medica di Guizhou, Centru di Ricerca di Tecnulugia d'Ingegneria per u Sviluppu è l'Applicazione di a Medicina Etnica è di a Medicina Tradizionale Cinese, Ministeru di l'Educazione, Laboratoriu Chjave Provinciale di Farmacia di Guizhou, Università Medica di Guizhou, Guiyang, Repubblica Pupulare Cinese; 4 Dipartimentu di Gastroenterologia, Ospedale di Shenzhen di l'Università di Pechino, Shenzhen, Repubblica Pupulare Cinese; 5 Scola di Farmacia, Università Medica di Guizhou, Laboratoriu Chjave Statale di a Funzione è l'Applicazione di e Piante Medicinali, Guiyang; 6 Dipartimentu di Medicina di Laboratoriu, Ospedale Universitariu di Pechino Shenzhen, Shenzhen, Cina [email protected] Shen Xiangchun, Scola di Farmacia, Università Medica di Guizhou, Guizhou, Repubblica Popolare Cinese, 550004, Email [email protected] Obiettivu: A terapia basata nantu à GLP-1 hè una nova opzione di trattamentu per a malatia infiammatoria intestinale. I granuli di Ban-Lan-Gen (BLG) sò una formulazione antivirale di MTC cunnisciuta chì presenta una putenziale attività antiinflamatoria in u trattamentu di varie cundizioni infiammatorie. Tuttavia, u so effettu antiinflamatoriu nantu à a colite è u so mecanismu d'azione ùn sò ancu chjari. METODI: Per stabilisce a colite cronica recidivante indotta da u sulfatu di sodiu di destranu (DSS) in i topi. L'indici di attività di a malatia, i marcatori istologichi di ferita è i livelli di citochine proinfiammatorie sò stati realizati per valutà l'effettu protettivu di BLG. L'effetti di BLG nantu à a microbiota intestinale è l'intestinu sò stati caratterizati da i livelli sierichi di GLP-1 è l'espressione colonica di Gcg, GPR41 è GRP43, a cumpusizione di a microbiota intestinale, i livelli di SCFA fecali è u rilasciu di GLP-1 da u primariu Cellule epiteliali di u colon di topu Produzione di GLP-1 derivata da SCFA. Risultati: U trattamentu BLG hà riduttu significativamente a perdita di pesu corpurale, DAI, accorciamentu di u colon, danni à i tessuti di u colon è livelli di citochine proinfiammatorie di TNF-α, IL-1β è IL-6 in u tissutu di u colon. Inoltre, u trattamentu BLG pò restaurà significativamente l'espressione di Gcg, GPR41 è GRP43 di u colon è i livelli sierichi di GLP-1 in i topi di colite, è aumentendu i batteri chì producenu SCFA cum'è Akkermansia è Prevotellaceae_UCG-001, è riducendu l'abbundanza di batteri cum'è Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas è Oscillibacter. Inoltre, u trattamentu BLG pò aumentà significativamente u livellu di SCFA in e feci di i topi di colite. À u listessu tempu, l'esperimenti in vitro anu ancu dimustratu chì l'estrattu fecale di i topi trattati cù BLG pò stimulà assai e piccule cellule epiteliali di u colon murine primarie chì secernunu GLP-1. Conclusioni: Sti risultati suggerenu chì BLG hà un effettu anticolite. BLG hà u putenziale per esse sviluppatu cum'è terapia, almenu in parte modulendu a microbiota intestinale è restaurendu a pruduzzione di GLP-1 derivata da SCFA intestinale. Farmaci promettenti per a colite cronica recidivante. Parole chjave: colite, granuli di Ban-Lan-Gen, microbiota intestinale, acidi grassi à catena corta, GLP-1.
A colite ulcerosa (CU) hè una malatia infiammatoria à longu andà di u colon è di u rettu carattarizata da diarrea recurrente, dolore addominale, perdita di pesu è feci sanguinolente mucopurulente.1 Recentemente, a prevalenza di a CU hè aumentata in i paesi prima à bassa incidenza, cumprese a Cina, cù a crescente pupularità di i stili di vita occidentali.2 Questu aumentu pone prublemi maiò per a salute publica è hà implicazioni serie per a capacità di i pazienti di travaglià è a qualità di vita. In particulare, a patogenesi di a CU ferma in gran parte pocu chjara, ma hè generalmente accettatu chì a genetica, i fattori ambientali, a microbiota intestinale è u sistema immunitariu cuntribuiscenu tutti à u sviluppu di a CU.3 Ancu avà, ùn ci hè micca cura per a CU, è l'ubbiettivu di u trattamentu hè clinicamente di cuntrullà i sintomi clinichi, induce è mantene a remissione, prumove a guarigione di a mucosa è riduce a recidiva. I trattamenti classici includenu aminosalicilati, corticosteroidi, immunosoppressori è biologichi. Tuttavia, questi farmaci ùn ponu micca ottene l'effettu desideratu per via di i so vari effetti secundari.4 Recentemente, parechji studii di casu anu dimustratu chì a medicina tradiziunale cinese (MTC) hà dimustratu un grande putenziale per aiutà per alleviare a CU cù una bassa tossicità, ciò chì suggerisce chì u sviluppu di nuove terapie TCM hè una strategia di trattamentu promettente per a CU.5-7
I Granuli di Banlangen (BLG) sò una preparazione di medicina tradiziunale cinese fatta da l'estrattu acquosu di a radica di Banlangen.8 In più di a so efficacia antivirale, BLG presenta una putenziale attività antiinflamatoria in u trattamentu di varie condizioni infiammatorie.9,10 Inoltre, i glucosinolati (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorubina è glucoside sò stati isolati è identificati da estratti acquosi di Radix isatidis) è nucleosidi (ipoxantina, adenosina, uridina è guanosina) è alcaloidi di l'indigo cum'è l'indirubina.11,12 Studi precedenti anu ben documentatu chì i cumposti adenosina, uridina è indirubina presentanu potenti effetti anticolite in diversi mudelli animali di colite.13-17 Tuttavia, ùn sò stati realizati studii basati nantu à l'evidenza per valutà l'efficacia di BLG in a colite. In u presente studiu, avemu investigatu l'effettu protettivu di BLG nantu à a colite cronica recidivante indotta da solfatu di sodiu destrano (DSS) in topi C57BL/6 è avemu trovu chì L'amministrazione orale di BLG hà attenuatu significativamente u colon cronicu recidivante induttu da DSS in i topi L'inflammazione, i so meccanismi regulatori sò assuciati à a modulazione di a microbiota intestinale è à a restaurazione di a pruduzzione di peptide-1 simile à u glucagone derivatu da l'intestinu (GLP-1).
I granuli BLG (senza zuccheru, appruvati da NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pechino, Cina; numeru di lottu: 20110966) sò stati acquistati da e farmacie. DSS (Pesu Moleculare: 36.000-50.000 Daltons) hè statu acquistatu da MP Biologicals (Santa Ana, USA). Sulfasalazina (SASP) (purezza ≥ 98%), ematossilina è eosina sò stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). I ​​kit di analisi Elisa luminex TNF-α, IL-1β è IL-6 di topo sò stati acquistati da R&D systems (Minneapolis, MN, USA). L'acidu aceticu, l'acidu propionicu è l'acidu butiricu sò stati acquistati da Aladdin Industries (Shanghai, Cina). L'acidu 2-etilbutiricu hè statu acquistatu da Merck KGaA (Darmstadt, Germania).
Topi C57BL/6 maschili di 6-8 settimane (pesu corpurale 18-22 g) sò stati acquistati da Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pechino, Cina) è allughjati in un ambiente di 22 ± 2 °C cù un ciclu di 12 ore di luce/scurità. I ​​topi sò stati alimentati cù una dieta standard di roditori cù accessu liberu à l'acqua potabile per una settimana per acclimatassi à u novu ambiente. I topi sò stati poi divisi à casu in quattru gruppi: gruppu di cuntrollu, gruppu mudellu DSS, gruppu trattatu cù SASP (200 mg/kg, orale) è gruppu trattatu cù BLG (1 g/kg, orale). Cum'è mostratu in a Figura 1A, secondu u nostru studiu precedente, a colite cronica recidivante sperimentale hè stata indotta in i topi da trè cicli di 1,8% DSS per 5 ghjorni, seguita da acqua distillata per 7 ghjorni, secondu u nostru studiu precedente. 18 Topi in i gruppi trattati cù SASP è BLG sò stati trattati cù SASP è BLG, rispettivamente, ogni ghjornu à partesi da u ghjornu 0. Sicondu esperimenti preliminari, a dosa di BLG hè statu fissatu à 1 g/kg. Intantu, a dosa di SASP hè stata fissata à 200 mg/Kg secondu a literatura.4 I gruppi di cuntrollu è di mudellu DSS anu ricevutu u listessu vulume d'acqua durante tuttu l'esperimentu.
Figura 1 BLG migliora a colite cronica recidivante indotta da DSS in i topi. (A) Disegnu sperimentale di colite cronica ricorrente è trattamentu, (B) cambiamentu di pesu corpurale, (C) puntuazione di l'indice di attività di a malattia (DAI), (D) lunghezza di u colon, (E) maghjina rappresentativa di u colon, (F) Colorazione H&E di u colon (ingrandimentu, ×100) è (G) puntuazione istologica. I dati sò presentati cum'è media ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 o ###p < 0,001 vs gruppu di cuntrollu (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 vs gruppu DSS.
U pesu corpurale, a consistenza di e feci è u sanguinamentu rettale sò stati registrati ogni ghjornu. L'indice di attività di a malatia (DAI) hè statu determinatu cumbinendu punteggi di pesu corpurale, consistenza di e feci è sanguinamentu rettale cum'è descrittu prima.19 À a fine di l'esperimentu, tutti i topi sò stati eutanasizati è sangue, feci è colon sò stati raccolti per ulteriori esperimenti.
U tissutu di u colon hè statu fissatu in formalina è inclusu in paraffina. Sezioni di 5 micron sò state fatte è colorate cù ematossilina-eosina (H&E), poi accecate è valutate cum'è descrittu prima.19
L'ARN tutale di u tissutu di u colon hè statu estrattu cù u reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguitu da l'estrazione di cDNA cù a trascrittasi inversa (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Giappone). A PCR quantitativa hè stata realizata utilizendu un sistema PCR in tempu reale cù SYBR Green Master (Roche, Basilea, Svizzera). I trascritti di u genu bersagliu sò stati nurmalizati à β-actina è i dati sò stati analizati utilizendu u metudu 2-ΔΔCT. E sequenze di primer di u genu sò mostrate in a Tabella 1.
L'isolamentu è a cultura di e cellule epiteliali di u colon primariu di u topu sò stati realizati cum'è descrittu prima.20 In breve, i colon di topi di 6-8 settimane sò stati prima escisi dopu u sacrifiziu per dislocazione cervicale, poi aperti longitudinalmente, trattati cù a Soluzione Salina Bilanciata di Hanks (HBSS, senza calciu è magnesiu) è tagliati in 0,5-1 mm di picculi pezzi. In seguitu, i tessuti sò stati digeriti cù 0,4 mg/mL di collagenasi XI (Sigma, Poole, UK) in mezu DMEM liberu è centrifugati à 300 xg per 5 minuti à temperatura ambiente. Risuspende u pellet in mezu DMEM (supplementatu cù u 10% di serum fetale bovinu, 100 Unità/mL di penicillina è 100 µg/mL di streptomicina) à 37 °C è passa per una maglia di nylon (dimensione di i pori ~250 µm). Aliquote di cellule epiteliali di u colon sò state piazzate in piatti à fondu di vetru è incubate cù acidu aceticu, acidu propionicu, acidu butiricu è estratti fecali di topu per 2 ore à 37°C, 5% CO2.
U tissutu di u colon hè statu omogeneizatu cù PBS, è i livelli di citochine IL-6, TNF-α è IL-1β in u tissutu di u colon sò stati rilevati cù i kit di analisi ELISA luminex (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). In listessu modu, i livelli di GLP-1 in u serumu è in u mezu di cultura di e cellule epiteliali murine primarie di u colon sò stati determinati cù un kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, Cina) secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
L'ADN tutale da e feci hè statu estrattu cù un kit d'estrazione di l'ADN (Tiangen, Cina). A qualità è a quantità di l'ADN sò state misurate à i rapporti di 260 nm/280 nm è 260 nm/230 nm, rispettivamente. In seguitu, aduprendu ogni ADN estrattu cum'è mudellu, i primer specifichi 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) è 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) sò stati aduprati per amplificà e regioni V3-V4 di u genu rRNA 16S in diverse regioni. I prudutti PCR sò stati purificati aduprendu u Kit d'Estrazione di Gel QIAquick (QIAGEN, Germania), quantificati da PCR in tempu reale è sequenziati aduprendu a piattaforma di sequenziamentu IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., CA, USA). Per l'analisi bioinformatica, l'elaborazione di i dati hè stata effettuata seguendu i protocolli riportati prima.21,22 In breve, aduprate Cutadapt (V1.9.1) per filtrà i fugliali express grezzi. L'OTU sò stati raggruppati aduprendu UPARSE. (versione 7.0.1001) cù un limite di similarità di 97%, è UCHIME hè statu utilizatu per rimuovere e sequenze chimeriche. L'analisi è a classificazione di a cumpusizione di a cumunità sò state realizate utilizendu u classificatore RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) basatu annantu à a basa di dati di u genu di l'ARN ribosomiale SILVA.
I livelli di acidi grassi à catena corta (acidu aceticu, acidu propionicu è acidu butiricu) sò stati misurati cum'è descrittu prima da Tao et al., cù alcune mudificazioni.23 In breve, 100 mg di feci sò stati prima suspesi in 0,4 mL d'acqua deionizzata, seguitati da 0,1 mL di acidu sulfuricu à 50% è 0,5 mL di acidu 2-etilbutiricu (standard internu), poi omogeneizzati è riscaldati à 4 ° C. Centrifugà à 12.000 rpm per 15 minuti à C. U surnatante hè statu estrattu cù 0,5 mL d'etere è iniettatu in u GC per l'analisi. Per l'analisi di a cromatografia in gas (GC), i campioni sò stati analizati cù un cromatografu in gas GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) equipatu cù un rilevatore di ionizazione di fiamma (FID). A separazione hè stata ottenuta cù una colonna ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Cina). I dati sò stati acquisiti cù u software di soluzione GC (Shimadzu, Inc.). U rapportu di divisione era 10:1, u gas vettore era azotu è a velocità di flussu era 6 mL/min. U vulume di iniezione era 1 μL. A temperatura di l'iniettore è di u rilevatore era 300 °C. A temperatura di u fornu hè stata mantenuta à 140 °C per 13,5 minuti, poi aumentata à 250 °C à una velocità di 120°C/min; a temperatura hè stata mantenuta per 5 minuti.
I dati sò presentati cum'è media ± errore standard di a media (SEM). A significatività di i dati hè stata valutata da ANOVA à una via seguita da u test di gamma multipla di Duncan. U software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) hè statu utilizatu per tutti i calculi è p < 0,05 hè statu cunsideratu statisticamente significativu.
Hè ben cunnisciutu chì a CU hè una malatia di colite cronica recidivante cù dolore addominale severu, diarrea è sanguinamentu. Dunque, a colite cronica recidivante indotta da DSS in i topi hè stata stabilita per valutà l'efficacia anticolite di BLG (Fig. 1A). Paragunatu à u gruppu di cuntrollu, i topi in u gruppu di u mudellu DSS avianu un pesu corpurale significativamente riduttu è un DAI più altu, è questi cambiamenti sò stati significativamente invertiti dopu à 24 ghjorni di trattamentu BLG (Figura 1B è C). L'accorciamentu di u colon hè una caratteristica impurtante di a CU. Cum'è mostratu in e Figure 1D è E, a lunghezza di u colon di i topi chì anu ricevutu DSS hè stata significativamente accorciata, ma hè stata alleviata da u trattamentu BLG. In seguitu, hè stata realizata un'analisi istopatologica per valutà l'inflammazione colonica. L'imaghjini colorate cù H&E è i punteggi patologichi anu dimustratu chì l'amministrazione di DSS hà disturbatu significativamente l'architettura colonica è hà risultatu in a distruzzione di e cripte, mentre chì u trattamentu BLG hà riduttu significativamente a distruzzione di e cripte è i punteggi patologichi (Figura 1F è G). In particulare, l'effettu protettivu di BLG à una dosa di 1 g/Kg era paragunabile à quellu di SASP à un dosa di 200 mg/Kg. In generale, sti risultati suggerenu chì BLG hè efficace per riduce a gravità di a colite cronica recidivante indotta da DSS in i topi.
TNF-α, IL-1β è IL-6 sò marcatori inflammatori impurtanti di l'inflammazione di u colon. Cum'è mostratu in a Figura 2A, DSS hà induttu un aumentu significativu di l'espressione genica di TNF-α, IL-1β è IL-6 in u colon paragunatu à u gruppu di cuntrollu. L'amministrazione di BLG pò inverte significativamente questi cambiamenti mediati da DSS. Dopu, avemu utilizatu ELISA per determinà i livelli di e citochine inflammatorie TNF-α, IL-1β è IL-6 in u tissutu di u colon. I risultati anu ancu dimustratu chì i livelli colonichi di TNF-α, IL-1β è IL-6 eranu significativamente aumentati in i topi trattati cù DSS, mentre chì u trattamentu BLG hà alleviatu questi aumenti (Figura 2B).
Figura 2 BLG inibisce l'espressione genica è a pruduzzione di e citochine proinfiammatorie TNF-α, IL-1β è IL-6 in u colon di topi trattati cù DSS. (A) Espressione genica colonica di TNF-α, IL-1β è IL-6; (B) livelli di proteine ​​coloniche di TNF-α, IL-1β è IL-6. I dati sò presentati cum'è media ± SEM (n = 4-6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 o ###p < 0,001 vs gruppu di cuntrollu (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 vs gruppu DSS.
A disbiosi intestinale hè critica in a patogenesi di a UC.24 Per investigà se BLG modula a microbiota intestinale di i topi trattati cù DSS, hè statu realizatu u sequenziamentu di rRNA 16S per analizà a cumunità batterica di u cuntenutu intestinale. U diagramma di Venn mostra chì i trè gruppi spartenu 385 OTU. À u listessu tempu, ogni gruppu avia OTU unichi (Fig. 3A). Inoltre, l'indice Chao1 è l'indice Shannon mostrati in a Figura 3B è C anu dimustratu chì a diversità di a cumunità di a microbiota intestinale era ridutta in i topi trattati cù BLG, postu chì l'indice Shannon era significativamente diminuitu in u gruppu trattatu cù BLG. L'analisi di i cumpunenti principali (PCA) è l'analisi di e coordinate principali (PCoA) sò state aduprate per determinà i mudelli di clustering trà i trè gruppi è anu dimustratu chì a struttura di a cumunità di i topi trattati cù DSS era chjaramente separata dopu u trattamentu BLG (Figura 3D è E). Questi dati suggerenu chì u trattamentu BLG hà influenzatu significativamente a struttura di a cumunità di i topi cù colite indotta da DSS.
Figura 3 BLG altera a diversità di a microbiota intestinale in i topi cù colite indotta da DSS. (A) Diagramma di Venn di OTU, (B) Indice Chao1, (C) Indice di ricchezza di Shannon, (D) Graficu di puntuazione di l'Analisi di i Cumponenti Principali (PCA) di OTU, (E) Figura di puntuazione di l'Analisi di e Coordinate Principali OTU (PCoA). I ​​dati sò presentati cum'è media ± SEM (n = 6). **p < 0,01 vs gruppu DSS.
Per valutà i cambiamenti specifichi in a microbiota fecale, avemu analizatu a cumpusizione di a microbiota intestinale à tutti i livelli tassonomichi. Cum'è mostratu in a Figura 4A, i principali phyla in tutti i gruppi eranu Firmicutes è Bacteroidetes, seguitati da Verrucomicrobia. L'abbundanze relative di Firmicutes è i rapporti Firmicutes/Bacteroidetes sò stati significativamente aumentati in e cumunità microbiche fecali di i topi trattati cù DSS paragunatu à i topi di cuntrollu, è questi cambiamenti sò stati significativamente invertiti dopu u trattamentu BLG. In particulare, u trattamentu BLG hà aumentatu significativamente l'abbundanza relativa di Verrucobacterium in e feci di i topi cù colite indotta da DSS. À u livellu di a famiglia, e cumunità microbiche fecali eranu occupate da Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae è Prevotellaceae (Fig. 4B). Paragunatu à u gruppu DSS, l'esaurimentu di BLG hà aumentatu l'abbundanza di Akkermansiaceae, ma hà diminuitu l'abbundanza di Lachnospiraceae è Ruminococcaceae. In particulare, à u livellu di u genere, e feci... A microbiota era occupata da Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia è Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Questa scuperta hà ancu dimustratu chì u trattamentu BLG hà invertitu efficacemente u squilibriu di a microbiota in risposta à a sfida DSS, carattarizatu da una diminuzione di Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas è Oscillibacter, è un aumentu di Akkermansia è Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4 BLG altera l'abbundanza di a microbiota intestinale in i topi cù colite indotta da DSS. (A) Abbundanza di a microbiota intestinale à u livellu di u phylum; (B) Abbundanza di a microbiota intestinale à u livellu di a famiglia; (C) Abbundanza di a microbiota intestinale à u livellu di u genere. I dati sò presentati cum'è media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ### p < 0,001 vs gruppu di cuntrollu (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 o ***p < 0,001 vs gruppu DSS.
Cunsiderendu chì l'acidi grassi à catena corta (SCFA) sò i principali metaboliti di Akkermansia è Prevotellaceae_UCG-001, mentre chì l'acetatu, u propionatu è u butirratu sò i SCFA più abbundanti in u lume intestinale, 25-27 simu sempre in u nostru studiu. Cum'è mostratu in a Figura 5, e concentrazioni fecali di acetatu, propionatu è butirratu sò state significativamente ridotte in u gruppu trattatu cù DSS, mentre chì u trattamentu BLG puderia in gran parte supprime sta riduzione.
Figura 5. BLG aumenta i livelli di SCFA in e feci di topi cù colite indotta da DSS. (A) Cuntenutu d'acidu aceticu in e feci; (B) cuntenutu d'acidu propionicu in e feci; (C) cuntenutu d'acidu butiricu in e feci. I dati sò presentati cum'è media ± SEM (n = 6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 vs gruppu di cuntrollu (Con); *p < 0,05 o **p < 0,01 vs gruppu DSS.
Avemu ancu calculatu u coefficientu di currelazione di Pearson trà SCFA differenziale à livellu di genere è microbiota fecale. Cum'è mostratu in a Figura 6, Akkermansia era pusitivamente correlata cù a pruduzzione di acidu propionicu (Pearson = 0.4866) è acidu butirricu (Pearson = 0.6192). In cuntrastu, sia Enteromonas sia Oscillobacter eranu negativamente assuciati cù a pruduzzione di acetatu, cù coefficienti di Pearson di 0.4709 è 0.5104, rispettivamente. In listessu modu, Ruminococcaceae_UCG-014 era negativamente correlata cù a pruduzzione di acidu propionicu (Pearson = 0.4508) è acidu butirricu (Pearson = 0.5842), rispettivamente.
Figura 6 Analisi di currelazione di Pearson trà SCFA differenziali è microbi di u colon. (A) Enteromonas cù acidu aceticu; (B) Bacillu di concussione cù acidu aceticu; (C) Akkermansia vs acidu propionicu; (D) Ruminococcus_UCG-014 cù acidu propionicu; (E) Akkermansia cù acidu butirricu; (F) Ruminococcus _UCG-014 cù acidu butirricu.
U peptide-1 simile à u glucagonu (GLP-1) hè un pruduttu post-traduzionale specificu di u tipu cellulare di proglucagonu (Gcg) cù proprietà antiinflamatorie.28 Cum'è mostratu in a Figura 7, DSS hà induttu una diminuzione significativa di l'espressione di l'mRNA di Gcg. U trattamentu di u colon è di BLG puderia inverte significativamente a riduzione di Gcg indotta da DSS paragunata à u gruppu di cuntrollu (Fig. 7A). À u listessu tempu, u livellu di GLP-1 in u serum era significativamente riduttu in u gruppu trattatu cù DSS, è u trattamentu BLG puderia impedisce in gran parte sta riduzione (Fig. 7B). Siccomu l'acidi grassi à catena corta ponu stimulà a secrezione di GLP-1 attraversu l'attivazione di u receptore 43 accoppiatu à a proteina G (GRP43) è di u receptore 41 accoppiatu à a proteina G (GRP41), avemu ancu esaminatu GPR41 è GRP43 in u colon di topi cù colite è avemu trovu chì l'espressione di l'mRNA colonicu di GRP43 è GPR41 era significativamente diminuita dopu a sfida DSS, è u trattamentu BLG puderia salvà efficacemente queste diminuzioni (Figura 7C è D).
Figura 7 BLG aumenta i livelli sierichi di GLP-1 è l'espressione di mRNA di Gcg, GPR41 è GRP43 in u colon in i topi trattati cù DSS. (A) Espressione di mRNA di Gcg in u tissutu di u colon; (B) Livellu di GLP-1 in u sieru; (C) Espressione di mRNA di GPR41 in u tissutu di u colon; (D) Espressione di mRNA di GPR43 in u tissutu di u colon. I dati sò presentati cum'è media ± SEM (n = 5-6). #p < 0,05 o ##p < 0,01 vs gruppu di cuntrollu (Con); *p < 0,05 vs gruppu DSS.
Siccomu u trattamentu BLG puderia aumentà i livelli sierichi di GLP-1, l'espressione di mRNA di Gcg colonicu è i livelli fecali di SCFA in i topi trattati cù DSS, avemu esaminatu ulteriormente l'acetatu, u propionatu è u butirratu, è ancu da i topi di cuntrollu (F-Con), colite DSS (F-Con) -DSS) è colite trattati cù BLG (F-BLG) nantu à a liberazione di GLP-1 da e cellule epiteliali coloniche murine primarie. Cum'è mostratu in a Figura 8A, e cellule epiteliali coloniche di u topu primarie trattate cù 2 mM di acidu aceticu, acidu propionicu è acidu butiricu, rispettivamente, anu stimulatu significativamente a liberazione di GLP-1, in cunfurmità cù studii precedenti.29,30 In listessu modu, tutti i F-Con, F-DSS è F-BLG (equivalenti à 0,25 g di feci) anu stimulatu assai a liberazione di GLP-1 da e cellule epiteliali coloniche murine primarie. In particulare, a quantità di GLP-1 liberata da e cellule epiteliali coloniche di u topu primarie trattate cù F-DSS era assai più bassa di quella di e cellule primarie trattate cù F-Con è F-BLG. cellule epiteliali di u colon di u topu (Figura 8B). Quessi dati suggerenu chì u trattamentu BLG hà restauratu significativamente a pruduzzione di GLP-1 derivata da SCFA intestinale.
Figura 8 L'SCFA derivatu da BLG stimula a liberazione di GLP-1 da e cellule epiteliali murine primarie di u colon. (A) L'acidu aceticu, l'acidu propionicu è l'acidu butirricu anu stimulatu a liberazione di GLP-1 da e cellule epiteliali murine primarie di u colon; (B) l'estratti fecali F-Con, F-DSS è F-BLG anu stimulatu e cellule epiteliali murine primarie di u colon Quantità di GLP-1 liberata. Aliquote di cellule epiteliali colon sò state piazzate in piastre di Petri à fondu di vetru è trattate cù 2 mM d'acidu aceticu, acidu propionicu, acidu butirricu è estratti fecali F-Con, F-DSS è F-BLG (equivalenti à 0,25 g di feci), rispettivamente. 2 ore à 37°C, 5% CO2, rispettivamente. A quantità di GLP-1 liberata da e cellule epiteliali murine primarie di u colon hè stata rilevata da ELISA. I dati sò presentati cum'è media ± SEM (n = 3). #p < 0,05 o ##p < 0,01 vs. biancu o F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Abbreviazioni: Ace, acidu aceticu; Pro, acidu propionicu; però, acidu butiricu; F-Con, estrattu fecale da topi di cuntrollu; F-DSS, estrattu fecale da topi di colite; F-BLG, da colon trattatu cù BLG Estratti fecali di topi infiammatori.
Classificata da l'Organizazione Mondiale di a Salute cum'è una malatia refrattaria, a CU hè diventata un periculu mundiale; Tuttavia, i metudi efficaci per predisce, prevene è trattà a malatia sò sempre limitati. Dunque, ci hè un bisognu urgente di esplorà è sviluppà nuove strategie terapeutiche sicure è efficaci per a UC. I preparati di medicina tradiziunale cinese sò una opzione promettente perchè parechje preparazioni di medicina tradiziunale cinese sò state dimustrate efficaci in u trattamentu di a UC in a pupulazione cinese in i seculi, è sò tutti organici biologichi è materiali naturali chì sò per u più innocui per l'omu è l'animali. 31,32 Stu studiu hà avutu cum'è scopu di circà una preparazione di medicina tradiziunale cinese sicura è efficace per u trattamentu di a UC è di esplorà u so mecanismu d'azione. BLG hè una formula di erbe cinese ben cunnisciuta aduprata per trattà l'influenza. 8,33 U travagliu in u nostru laburatoriu è altri hà dimustratu chì l'indaco, un pruduttu di medicina tradiziunale cinese trasfurmatu da a stessa materia prima di BLG, mostra una efficacia significativa in u trattamentu di a UC in l'omu è l'animali. 4,34 Tuttavia, l'effetti anti-colitici di BLG è i so effetti U mecanismu ùn hè chjaru. In u studiu attuale, i nostri risultati dimustranu chì BLG attenua efficacemente l'inflammazione colonica indotta da DSS, chì hè assuciata à a modulazione di a microbiota intestinale è restaurazione di a pruduzzione di GLP-1 derivata da l'intestinu.
Hè ben cunnisciutu chì a CU hè carattarizata da periodi recidivanti cù caratteristiche cliniche tipiche, cum'è perdita di pesu, diarrea, sanguinamentu rettale è danni estensivi à a mucosa di u colon.35 Cusì, a colite cronica recidivante hè stata amministrata amministrendu trè cicli di DSS à l'1,8% per cinque ghjorni, seguiti da sette ghjorni d'acqua potabile. Cum'è mostratu in a Figura 1B, a perdita di pesu fluttuante è i punteggi DAI indicavanu una induzione riescita di a colite cronica recidivante. I topi in u gruppu trattatu cù BLG anu mostratu una ripresa in crescita da u ghjornu 8, chì era significativamente diversa da u ghjornu 24. I stessi cambiamenti sò stati osservati ancu in u punteggio DAI, chì suggerisce un miglioramentu in u miglioramentu clinicu di a colite. In termini di lesioni di u colon è di statu infiammatoriu, a lunghezza di u colon, u dannu à u tissutu di u colon, è l'espressione genica è a pruduzzione di e citochine proinfiammatorie TNF-α, IL-1β è IL-6 in u tissutu di u colon sò stati ancu assai migliorati dopu u trattamentu BLG. Cullettivamente, questi risultati dimostranu chjaramente chì BLG hè efficace in u trattamentu di a colite cronica recidivante in i topi.
Cumu BLG esercita i so effetti farmacologichi? Numerosi studii precedenti anu dimustratu chì a microbiota intestinale ghjoca un rolu chjave in a patogenesi di a UC, è e terapie basate nantu à u microbioma è mirate à u microbioma sò emerse cum'è una strategia assai attraente per u trattamentu di a UC. In u presente studiu, avemu dimustratu chì u trattamentu BLG hà risultatu in cambiamenti significativi in ​​a cumpusizione di a microbiota intestinale, suggerendu chì l'effettu protettivu di BLG contr'à a colite indotta da DSS hè ligatu à a modulazione di a microbiota intestinale. Questa osservazione hè coerente cù l'idea chì a riprogrammazione di l'omeostasi di a microbiota intestinale hè un approcciu impurtante per capisce l'efficacia di e preparazioni di TCM. 36,37 In particulare, Akkermansia hè una batteria Gram-negativa è strettamente anaerobica chì vive in u stratu di mucus di l'intestinu, chì degrada e mucine, produce l'acidu propionicu, stimula a differenziazione di e cellule caliciformi è mantene a funzione di a mucosa di l'integrità di a barriera. 26 Dati clinichi è animali multipli suggerenu chì Akkermansia hè altamente assuciata cù una mucosa sana, 38 è l'amministrazione orale di Akkermansia spp. pò migliurà significativamente l'inflammazione di a mucosa.39 I nostri dati attuali suggerenu chì l'abbundanza relativa di Akkermansia hè significativamente aumentata dopu u trattamentu BLG. Inoltre, Prevotellaceae_UCG-001 hè una batteria chì produce SCFA.27 Diversi studii anu dimustratu chì Prevotellaceae_UCG-001 hè stata trovata in bassa abbundanza relativa in e feci di l'animali cù colite.40,41 I nostri dati attuali mostranu ancu chì u trattamentu BLG pò aumentà significativamente l'abbundanza relativa di Prevotellaceae_UCG-001 in u colon di i topi trattati cù DSS. In cuntrastu, Oscillibacter hè una batteria mesofila, strettamente anaerobica.42 hà riportatu chì l'abbundanza relativa di Oscillibacter era significativamente aumentata in i topi UC è era significativamente correlata pusitivamente cù i livelli di IL-6 è IL-1β è i punteggi patologichi.43,44 In particulare, u trattamentu BLG hà riduttu significativamente l'abbundanza relativa di Oscillibacter in e feci di i topi trattati cù DSS. In particulare, questi batteri alterati da BLG eranu i batteri chì producenu più SCFA. Numerosi studii precedenti anu dimustratu u putenziale beneficu Effetti di i SCFA nantu à l'inflammazione di u colon è a prutezzione di l'integrità epiteliale intestinale.45,46 I nostri dati attuali anu ancu osservatu chì e concentrazioni di acetatu di SCFA, propionatu è butirratu in e feci trattate cù DSS eranu assai aumentate in i topi trattati cù BLG. Pigliati inseme, sti risultati dimustranu chjaramente chì u trattamentu BLG pò migliurà efficacemente i batteri chì producenu SCFA indotti da DSS in i topi cù colite cronica recidivante.
U GLP-1 hè un'incretina prodotta principalmente in l'ileu è in u colon è ghjoca un rolu impurtante in u ritardu di u svuotamentu gastricu è in a diminuzione di a glicemia postprandiale.47 L'evidenza suggerisce chì a dipeptidil peptidasi (DPP)-4, un agonista di u receptore GLP-1, è una nanomedicina GLP-1 ponu alleviare efficacemente l'inflammazione intestinale in i topi.48-51 Cum'è riportatu in studii precedenti, alte concentrazioni di SCFA sò state assuciate à i livelli plasmatici di GLP-1 in l'omu è in i topi. 52 I nostri dati attuali mostranu chì dopu u trattamentu cù BLG, i livelli sierichi di GLP-1 è l'espressione di mRNA di Gcg sò stati significativamente aumentati. In listessu modu, a secrezione di GLP-1 hè stata significativamente aumentata in e culture coloniche dopu a stimulazione cù estratti fecali da topi di colite trattati cù BLG paragunatu à a stimulazione cù estratti fecali da topi di colite trattati cù DSS. Cumu l'SCFA influenzanu a liberazione di GLP-1? Gwen Tolhurst et al. anu signalatu chì SCFA pò stimulà a secrezione di GLP-1 per mezu di GRP43 è GPR41.29 I nostri dati attuali mostranu ancu chì u trattamentu BLG aumenta significativamente l'espressione di mRNA di GRP43 è GPR41 in u colon di topi trattati cù DSS. Quessi dati suggerenu chì u trattamentu BLG pò restaurà a pruduzzione di GLP-1 prumossa da SCFA attivendu GRP43 è GPR41.
BLG hè una droga senza ricetta (OTC) à longu andà in Cina. A dosa massima tollerata di BLG in i topi Kunming hè 80 g/Kg, è ùn hè stata osservata alcuna tossicità acuta.53 Attualmente, a dosa raccomandata di BLG (senza zuccheru) in l'omu hè 9-15 g/ghjornu (3 volte à ghjornu). U nostru studiu hà dimustratu chì BLG à 1 g/Kg hà migliuratu a colite cronica recidivante indotta da DSS in i topi. Questa dosa hè vicina à a dosa di BLG aduprata clinicamente. U nostru studiu hà ancu trovu chì u so mecanismu d'azione hè mediatu, almenu in parte, da alterazioni in a microbiota intestinale, in particulare batteri chì producenu SCFA, cum'è Akkermansia è Prevotellaceae_UCG-001, per restaurà a produzzione di GLP-1 derivata da l'intestinu. Queste scuperte suggerenu chì BLG merita ulteriore considerazione cum'è un potenziale agente terapeuticu per u trattamentu clinicu di a colite. Tuttavia, u mecanismu esattu per u quale modula a microbiota intestinale resta da esse cunfirmatu da topi cù deficit di microbiota è trapianto di batteri fecali.
Ace, acidu aceticu; ma, acidu butirricu; BLG, pandanu; DSS, sulfatu di sodiu di destranu; DAI, indice di attività di a malatia; DPP, dipeptidil peptidasi; FID, rivelatore di ionizazione di fiamma; F-Con, cuntrollu Estratti fecali di topi; F-DSS, estratti fecali di topi di colite DSS; F-BLG, estratti fecali di topi di colite trattati cù BLG; GLP-1, peptide-1 simile à u glucagone; Gcg, glucagone; gascromatografia, gascromatografia; GRP43, receptore 43 accoppiatu à a proteina G; GRP41, receptore 41 accoppiatu à a proteina G; H&E, ematossilina-eosina; HBSS, Soluzione Salina Bilanciata di Hanks; OTC, OTC; PCA, analisi di i cumpunenti principali; PCoA, analisi di e coordinate principali; Pro, acidu propionicu; SASP, sulfasalazina; SCFA, acidi grassi à catena corta; Medicina cinese, medicina tradiziunale cinese; UC, colite ulcerosa.
Tutti i protokolli sperimentali sò stati appruvati da u Cumitatu d'Etica Animale di u Centru Medicu di l'Università di Pechino Shenzhen-Hong Kong University of Science and Technology (Shenzhen, Cina) secondu e Linee Guida Istituzionali è i Regolamenti Animali (numeru d'etica A2020157).
Tutti l'autori anu fattu cuntribuzioni significative à a cuncepzione è u disignu, l'acquisizione di dati, o l'analisi è l'interpretazione di i dati; anu participatu à a redazione di l'articulu o à a revisione critica di u cuntenutu intellettuale impurtante; anu accunsentutu à presentà u manuscrittu à a rivista attuale; anu infine appruvatu a versione per a publicazione; Rispunsevuli di tutti l'aspetti di u travagliu.
Stu travagliu hè statu sustinutu da a Fundazione Naziunale di Scienze Naturali di Cina (81560676 è 81660479), u prughjettu di prima classe di l'Università di Shenzhen (86000000210), u Fondu di u Cumitatu per l'Innuvazione Scientifica è Tecnulugica di Shenzhen (JCYJ20210324093810026), è u Fondu di Ricerca Medica è Tecnulugica di a Pruvincia di Guangdong (A2020157 è A2020272), a Farmacia di l'Università Medica di Guizhou di a Pruvincia di Guizhou Finanziata da Key Laboratory (YWZJ2020-01) è l'Ospedale di Shenzhen di l'Università di Pechino (JCYJ2018009).
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