L'urdinamentu di e proteine ​​in a via secretoria hè essenziale per mantene a compartimentazione cellulare è l'omeostasi. In più di l'urdinamentu mediatu da a cunchiglia, u rolu di i lipidi in l'urdinamentu di e chinesine in u prucessu di trasportu secretoriu hè una quistione fundamentale di longa data chì ùn hè ancu stata risposta. Quì, realizemu imaging 3D simultaneu multicolore in tempu reale à alta risoluzione per dimustrà in vivo chì e proteine ​​immobilizzate cù glicosilfosfatidilinositolo appena sintetizate cù unità lipidiche di ceramide assai lunghe sò raggruppate è classificate in un situ di uscita netu di endoplasmi specializatu, chì hè diversu da quellu utilizatu da e proteine ​​transmembrana. Inoltre, mostremu chì a lunghezza di a catena di ceramide in a membrana di u reticulu endoplasmicu hè critica per sta selettività di urdinamentu. U nostru studiu furnisce a prima evidenza diretta in vivo per classificà i carichi di proteine ​​​​in basa à a lunghezza di a catena lipidica in siti di esportazione selettivi in ​​a via secretoria.
In e cellule eucariote, e proteine ​​sintetizate in u reticulum endoplasmicu (RE) sò tandu urdinate durante u trasportu attraversu a via secretoria per a consegna à a so destinazione cellulare adatta (1). In più di l'urdinamentu mediatu da u rivestimentu, hè statu longu speculatu chì certi lipidi ponu ancu serve cum'è punti di uscita selettivi raggruppenduli in duminii di membrana specifichi chì proteine ​​specifiche (2-5). Tuttavia, ci hè sempre una mancanza di prove dirette in vivo per pruvà questu pussibule mecanismu basatu annantu à i lipidi. Per risolve questu prublema basicu, avemu studiatu in u levitu cumu e proteine ​​ancorate à u glicosilfosfatidilinositolo (GPI) (GPI-AP) sò esportate in modu differenziale da u RE. I GPI-AP sò una varietà di proteine ​​di superficie cellulare cunnesse à i lipidi (6, 7). GPI-AP hè una proteina secreta attaccata à i fogli esterni di a membrana plasmatica attraversu a parte glicolipidica (ancora GPI). Accettanu ancore GPI cum'è mudificazioni post-traduzionali cunservative in u lume di u RE (8). Dopu l'attaccamentu, GPI-AP passa per l'apparatu di Golgi (5, 9) da u RE à a membrana plasmatica. A presenza di ancore GPI face chì GPI-AP sia trasportatu separatamente da e proteine ​​secrete transmembrana (cumprese altre proteine ​​di a membrana plasmatica) longu a via secretoria (5, 9, 10). In e cellule di lievito, i GPI-AP sò separati da altre proteine ​​secrete in u reticulum endoplasmaticu, è poi imballati in vescicole uniche avvolte da u cumplessu proteicu di rivestimentu II (COPII) (6, 7). I determinanti di stu prucessu di classificazione in u prucessu d'esportazione di u RE ùn sò micca chjari, ma si specula chì stu mecanismu pò richiede lipidi, in particulare u rimodellamentu strutturale di a parte lipidica di l'ancora GPI (5, 8). In u lievito, u rimodellamentu di i lipidi GPI principia subitu dopu chì u GPI si attacca, è in parechji casi, face chì a ceramide si leghi à l'acidu grassu saturatu à catena longa di 26 carbonii (C26:0) (11, 12). A ceramide C26 hè a principale ceramide prodotta da e cellule di lievito finu à avà. Hè sintetizzata in u RE è a maiò parte hè esportata versu l'apparatu di Golgi per mezu di vescicule COPII (13). L'esportazione di GPI-AP in u RE richiede specificamente una sintesi cuntinua di ceramide (14, 15), è à u so tornu, a cunversione di ceramide in ceramide di fosfatu d'inositol (IPC) in l'apparatu di Golgi dipende da a sintesi di l'ancora GPI (16). Studi biofisichi cù membrane artificiali anu dimustratu chì e ceramidi à catena acilica assai longa ponu coalesce per furmà duminii ordinati cù proprietà fisiche uniche (17, 18). Quessi dati portanu à l'ipotesi chì a ceramide C26 è GPI-AP cù a ceramide C26 utilizanu e so proprietà fisiche per coalesce in regioni ordinate o regioni in l'ambiente lipidicu di a membrana RE relativamente disordinatu. Hè principalmente cumposta da glicerolipidi corti è insaturi (C16:1 è C18:1) (19, 20). Queste regioni saranu focalizate selettivamente nantu à siti specifici di uscita di l'ER (ERES), induve a ceramide è a GPI-AP basata nantu à a ceramide ponu esse co-trasportate à u Golgi in a stessa vescicula COPII dedicata (5).
In questu studiu, avemu testatu direttamente questu mecanismu basatu annantu à i lipidi aduprendu a microscopia d'imaghjini in tempu reale cunfocale à super risoluzione (SCLIM), chì hè una tecnica di microscopia d'avanguardia chì pò osservà simultaneamente e proteine ​​marcate fluorescentemente. L'imaghjini tricolore è tridimensionali (3D) anu una risoluzione è una velocità estremamente elevate in e cellule viventi (21, 22).
Avemu prima applicatu a tecnulugia SCLIM per definisce megliu cumu a GPI-AP nurmale cù u gruppu di ceramide C26 hè stata screening da e proteine ​​secrete transmembrana dopu avè lasciatu u RE in S. cerevisiae. Per verificà a classificazione di u RE, avemu utilizatu un sistema geneticu chì pò visualizà direttamente u caricu appena sintetizatu chì entra in l'ERES in vivo (7, 23). Cum'è caricu, avemu sceltu GPI-AP Gas1 basatu annantu à a ceramide C26 marcatu cù a proteina fluorescente verde (GFP) è a proteina secreta transmembrana Mid2 marcata cù a proteina fluorescente vicinu à l'infrarossu (iRFP), tramindui chì miranu a membrana plasmatica (24-26). In u mutante sensibile à a temperatura sec31-1, sti dui carichi sò espressi sottu un promotore inducibile da u galattosiu è un marcatore ERES custitutivu. À a temperatura estrema (37 ° C), perchè a mutazione sec31-1 affetta a funzione di u cumpunente di rivestimentu COPII Sec31 per inibisce a germinazione di COPII è l'esportazione di ER, u caricu appena sintetizatu s'accumula à u RE (23). Dopu à u raffreddamentu à una bassa temperatura (24°C), e cellule mutanti sec31-1 si sò riprese da a zona secretoria, è u novu carcu sinteticu accumulatu hà cuminciatu à esse esportatu da u RE. A visualizazione CLIM hà dimustratu chì a maiò parte di u Gas1-GFP è Mid2-iRFP appena sintetizzati s'accumulavanu sempre in u RE di e cellule mutanti sec31-1 dopu l'incubazione à 37°C è dopu liberati à 24°C per 5 minuti (Figura 1). Siccomu Mid2-iRFP hè distribuitu nantu à tutta a membrana di u RE, è Gas1-GFP hè cuncintratu è riunitu in a zona discontinua di a membrana di u RE, a so distribuzione hè cumpletamente diversa (Figura 1, da A à C è Film S1). Inoltre, cum'è mostratu in a Figura 1D, u cluster Gas1-GFP ùn hà micca Mid2-iRFP. Questi risultati indicanu chì e proteine ​​GPI-AP è transmembrana sò state separate in diverse regioni di membrana di u RE prestu. U gruppu Gas1-GFP hè adiacente à un ERES specificu marcatu cù a proteina di rivestimentu COPII di mCherry Sec13 (Figura 1, E è F, è filmu S1) (23).
E cellule sec31-1 esprimenu secrezioni indotte da galattosio, una ceramide à catena acilica longa (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) è a proteina transmembrana Mid2-iRFP (TMP, blu) è sta marcatura ERES costruttiva Sec13-mCherry (ERES, magenta) hè stata incubata à 37°C per 30 minuti, spostata à 24°C, è fotografata da SCLIM 5 minuti dopu. (A à C) mostra una maghjina 2D fusa o unica rappresentativa di un pianu (A), una maghjina di pruiezione 2D di 10 sezioni z (B) o una maghjina 3D di l'emisferu cellulare di u cargu è di i marcatori ERES (C). Barra di scala 1μm (A è B). L'unità di scala hè 0,551μm (C). Gas1-GFP hè statu rilevatu in regioni o gruppi ER discreti, mentre chì Mid2-iRFP hè statu rilevatu è distribuitu in tutta a membrana ER (C). (D) U graficu mostra l'intensità relativa di fluorescenza di Gas1-GFP è Mid2-iRFP in u cluster Gas1-GFP longu a linea di freccia bianca (à manca). AU, unità arbitraria. (E è F) rapprisentanu l'imagine 3D chì combina i marchi di merci è ERES. I cluster Gas1-GFP sò stati rilevati vicinu à l'ERES specificu. L'unità di scala hè 0,551 μm. (F) A freccia bianca solida marca u cluster Gas1-GFP assuciatu à ERES. I pannelli centrali è di diritta mostranu l'imagine 3D ingrandita fusionata è una vista rotata di u cluster Gas1-GFP selezziunatu.
A stretta relazione spaziale trà u cluster Gas1-GFP è un ERES specificu indica chì Gas1-GFP pò entre in ERES selettivu, chì hè differente da a selettività aduprata da Mid2-iRFP per lascià l'ER. Per affruntà sta pussibilità, avemu quantificatu u rapportu ERES per solu una o duie merci (Figura 2, da A à C). Avemu trovu chì a maiò parte di l'ERES (70%) cuntenenu solu un tipu di carica. L'imagine in fondu di a Figura 2C mostra dui esempi tipici di ERES cù solu Gas1-GFP (Figura 1) o solu Mid2-iRFP (Figura 2). In cuntrastu, circa u 20% di l'ERES cuntene dui carichi chì si sovrapponenu in a stessa zona. Hè statu trovu chì alcuni ERES (10%) cuntenenu dui tipi di carica, ma eranu isolati in zone chiaramente diverse. Dunque, sta analisi statistica mostra chì dopu chì l'ER hè statu esportatu, GPI-AP Gas1-GFP è a carica transmembrana Mid2-iRFP sò divisi in diversi ERES (Figura 2D). Questa efficienza di classificazione hè assai coerente cù l'analisi biochimica precedente (6) è a determinazione morfologica (7). Pudemu ancu osservà u cumpurtamentu di u carcu in quarantena chì entra in ERES (Figura 2E è Film S2). A Figura 2E mostra chì solu una piccula parte di Gas1-GFP (pannellu 3) o Mid2-iRFP (pannellu 4) entra in l'ERES da una parte è hè cunfinata in una zona discreta. U pannellu 5 di a Figura 2E mostra chì Gas1-GFP è Mid2-iRFP si trovanu qualchì volta in u listessu ERES, ma entranu da lati diversi è sò cuncentrati in regioni separate chì ponu rapprisintà diverse vescicule COPII. Avemu ancu cunfirmatu chì a separazione è a classificazione osservata di GPI-AP Gas1 basatu nantu à a ceramide C26 cum'è ERES selettivu hè specifica perchè un altru carcu di secrezione transmembrana, a proteina di membrana plasmatica marcata cù GFP Axl2 (27), chì mostra un cumpurtamentu simile à Mid2-iRFP. (Foto S1 è Film S3). L'Axl2-GFP appena sintetizatu hè distribuitu attraversu a membrana RE cum'è Mid2-iRFP (Figura S1, A è B), è hè co-localizatu cù Mid2-iRFP in a maiò parte di l'ERES (Figura S1, da B à D). I pannelli 1 è 2 di a Figura 1. S1C mostranu dui esempi tipici di ERES induve dui carichi transmembrana si sovrappongono. In questi casi, e duie merci entranu in ERES inseme (Figura S1E, Pannellu 3 è Film S3).
E cellule sec31-1 chì esprimenu secrezioni inducibili da galattosiu, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) è Mid2-iRFP (TMP, blu) è a marcatura ERES custitutiva Sec13-mCherry (ERES, magenta) sò state piazzate à 37 °C. Dopu avè incubatu per 30 minuti à °C, spustate à 24 °C per liberà u bloccu di secrezione, è imaghjinate cù SCLIM dopu à 20 minuti. (Da A à C) Immagini di pruiezione 2D rappresentative (A; barra di scala, 1 μm) o immagini di l'emisferu cellulare 3D (B è C; unità di scala, 0,456 μm) di a carica è 10 sezioni z marcate da ERES. U pannellu inferiore in (B) è u pannellu in (C) mostranu immagini trasfurmate per visualizà solu e merci presenti in ERES (magenta) [Gas1-GFP (grisgiu) è Mid2-iRFP (blu chjaru)]. (C) Freccia aperta: ERES porta solu un pezzu di carica (da 1 à 4). Freccia grisgia: ERES cuntene carica segregata (5). Freccia bianca piena: ERES cuntene carica co-localizzata. Quì sottu: L'ERES unicu sceltu cuntene solu Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra di scala, 100 nm. (D) Quantificazione di a microfotografia descritta in (C). A percentuale media di ERES chì cuntene solu una carica (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), carica segregata è carica sovrapposta. In trè esperimenti indipendenti, n = 432 in 54 cellule. Barra d'errore = SD. Test t bidirezionale senza accoppiamenti. *** P = 0,0002. (E) Imagine 3D di ERES selezziunati di carica in quarantena marcata cù (C). Gas1-GFP (verde) (3) o Mid2-iRFP (blu) (4) entra in ERES (magenta) da una parte è hè limitatu à una piccula zona in ERES. Calchì volta, i dui tipi di carica entrenu in u listessu ERES (5) da u listessu latu è sò cunfinati in una zona isolata in l'ERES. Barra di scala, 100 nm.
Dopu, avemu testatu una ipotesi chì a ceramide à catena acilica longa (C26) presente in a membrana RE guida u raggruppamentu specificu è l'urdinamentu di Gas1 in ERES selettivi. À questu scopu, avemu utilizatu un ceppo di levitu mudificatu GhLag1, in u quale e duie ceramide sintasi endogene Lag1 è Lac1 sò state rimpiazzate da GhLag1 (l'omologu Lag1 di u cotone), risultendu in un ceppo di levitu cù un ceppo di Ceramide di membrana cellulare più cortu di u tipu salvaticu (Figura 3A) (28). L'analisi di spettrometria di massa (MS) hà dimustratu chì in i ceppi di tipu salvaticu, u 95% di a ceramide tutale hè ceramide à catena assai longa (C26), mentre chì in GhLag1, l'85% di a ceramide hè assai longa (C18 è C16). ), solu u 2% di a ceramide hè ceramide à catena assai longa (C26). Ancu s'è e ceramidi C18 è C16 sò e principali ceramidi rilevate in a membrana GhLag1 finu à avà, l'analisi MS hà ancu cunfirmatu chì l'ancora GPI di Gas1-GFP espressa in a ceppa GhLag1 cuntene ceramide C26, chì hè paragunabile à i lipidi di tipu salvaticu. A qualità hè a listessa (Fig. 3A) (26). Dunque, questu significa chì l'enzima di rimodellazione di a ceramide Cwh43 hè assai selettivu per a ceramide C26, cum'è mostratu in a Figura 26, incorpora preferenzialmente l'ancora GPI da una piccula quantità di ceramide C26 in a ceppa GhLag1. S2 (29). Tuttavia, a membrana cellulare di GhLag1 cuntene basicamente solu ceramide C18-C16, mentre chì Gas1-GFP hà sempre ceramide C26. Questu fattu face di sta ceppa un strumentu ideale per risolve specificamente u prublema di a lunghezza di a catena acilica di a ceramide di membrana in l'ER. U rolu ipoteticu di a classa è di l'urdinamentu. Dopu, avemu prima studiatu a capacità di C26 Gas1-GFP di accumulà si in gruppi in GhLag1 cù un allele mutante sensibile à a temperatura di sec31-1 per mezu di a microscopia di fluorescenza cunvinziunale, induve solu a catena longa (C18-C16) esiste in a membrana ER Ceramide (Fig. 3). Avemu osservatu chì in sec31-1, a maiò parte di Gas1-GFP era cuncintrata in gruppi, mentre chì Gas1-GFP in sec31-1 GhLag1 cù longa (C18-C16) membrana ER ceramide longa ùn era principalmente micca raggruppata è distribuita in tutta a membrana ER. Per esse precisi, postu chì u raggruppamentu basatu annantu à a ceramide C26 hè strettamente ligatu à ERES specifichi (Figura 1), avemu dopu investigatu se questu prucessu puderia ancu implicà a funzione di u mecanismu di proteine ​​d'esportazione ER. GPI-AP usa un sistema COPII speciale per l'esportazione ER, chì hè attivamente regulatu da u rimodellamentu strutturale di Ted1 di a parte glicana di l'ancora GPI (30, 31). U GPI-glicanu ricombinante hè tandu ricunnisciutu da u cumplessu p24 di u receptore di carica transmembrana, chì à u so tornu recluta selettivamente Lst1, chì hè una isoforma specifica di a principale subunità di legame di carica COPII Sec24, furmendu una vescicula COPII ricca di GPI-AP sò necessarie (31-33). Dunque, avemu custruitu un doppiu mutante chì hà cumminatu a delezione di ste proteine ​​singole (u cumpunente di u cumplessu p24 Emp24, l'enzima di rimodellamentu GPI-glicanu Ted1 è a subunità specifica COPII Lst1) cù u ceppu mutante sec31-1, è li avemu studiati. Hè pussibule furmà GFP à cluster Gas1 (Figura 3). Avemu osservatu chì in sec31-1emp24Δ è sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP hè principalmente senza cluster è distribuitu in tutta a membrana ER, cum'è vistu prima in sec31-1 GhLag1, mentre chì in sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP cum'è sec31-1. Questi risultati indicanu chì, in più di a presenza di ceramide C26 in a membrana ER, u raggruppamentu di Gas1-GFP hà ancu bisognu di ligà si à u cumplessu p24, è ùn richiede micca un recrutamentu specificu di Lst1. Dopu, avemu esploratu a pussibilità chì a lunghezza di a catena di ceramide in a membrana ER pò regulà u ligame di Gas1-GFP à p24. Tuttavia, avemu trovu chì a presenza di ceramide C18-C16 in a membrana ùn influenza micca i GPI-glicani ricustruiti da u cumplessu p24 (Figure S3 è S4, A è B) o u ligame à GPI-AP è l'esportazione di GPI-AP. capacità. Reclutà u sottotipu COPII Lst1 (Figura S4C). Dunque, u raggruppamentu dipendente da a ceramide C26 ùn richiede micca interazzione di proteine ​​cù diversi meccanismi di esportazione di proteine ​​ER, ma supporta un mecanismu di classificazione alternativu guidatu da a lunghezza lipidica. Dopu, avemu analizatu se a lunghezza di a catena acilica di ceramide in a membrana ER hè impurtante per a classificazione efficace di Gas1-GFP cum'è ERES selettivu. Siccomu Gas1 in a ceppa GhLag1 cù ceramide à catena corta lascia l'ER è entra in a membrana plasmatica (Figura S5), pensemu chì se l'urdinamentu hè guidatu da a lunghezza di a catena acilica di ceramide, u Gas1 in a ceppa GhLag1 pò esse reindirizzatu è incruciatu. Beni ERES cù a listessa membrana.
(A) A membrana cellulare di GhLag1 cuntene principalmente ceramidi C18-C16 più corte, mentre chì l'ancora GPI di Gas1-GFP hà sempre u listessu IPC C26 cum'è e cellule di tipu salvaticu. Sopra: analisi di a lunghezza di a catena acilica di a ceramide in a membrana cellulare di i ceppi di tipu salvaticu (Wt) è GhLag1p per spettrometria di massa (MS). I dati rapprisentanu a percentuale di ceramide tutale. A media di trè esperimenti indipendenti. Barra d'errore = SD. Test t bidirezionale non appaiato. **** P <0,0001. Pannellu inferiore: analisi MS di a lunghezza di a catena acilica di l'IPC presente in l'ancora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) espressa in i ceppi di tipu salvaticu è GhLag1p. I dati rapprisentanu a percentuale di u signale IPC tutale. Media di cinque esperimenti indipendenti. Barra d'errore = SD. Test t bidirezionale non appaiato. ns, micca impurtante. P = 0,9134. (B) Micrografie di fluorescenza di e cellule sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ è sec31-1lst1Δ chì esprimenu Gas1-GFP induttu da galattosiu sò state incubate à 37°C per 30 minuti è trasmesse à Eseguisce una microscopia di fluorescenza di rutina dopu à 24°C. Freccia bianca: cluster di Gas1-GFP ER. Freccia aperta: Gas1-GFP micca clusterizatu hè distribuitu nantu à tutta a membrana ER, mustrendu a culurazione di l'anellu nucleare caratteristica di ER. Barra di scala, 5μm. (C) Quantificazione di a microfotografia descritta in (B). A percentuale media di cellule cù struttura punteggiata di Gas1-GFP. In trè esperimenti indipendenti, n≥300 cellule. Barra d'errore = SD. Test t spaiatu à duie code. **** P <0.0001.
Per risolve direttamente stu prublema, avemu realizatu una visualizazione SCLIM di Gas1-GFP è Mid2-iRFP in GhLag1 cù l'allele mutante sensibile à a temperatura sec31-1 (Figura 4 è Film S4). Dopu chì l'ER hè statu ritenutu à 37°C è successivamente liberatu à 24°C, a maiò parte di u Gas1-GFP appena sintetizatu ùn era micca raggruppatu è distribuitu in tutta a membrana ER, cum'è osservatu da i microscopi convenzionali (Figura 4, A è B). Inoltre, una grande percentuale di ERES (67%) include dui tipi di carichi co-localizzati in questu (Figura 4D). I pannelli 1 è 2 di a Figura 4C mostranu dui esempi tipici di ERES cù Gas1-GFP è Mid2-GFP sovrapposti. Inoltre, tramindui i beni sò stati reclutati in u listessu ERES (Figura 4E, pannellu 3 è film S4). Dunque, i nostri risultati indicanu chì a lunghezza di a catena acilica di ceramide in a membrana ER hè un determinante impurtante di l'aggregazione è a classificazione di e proteine ​​ER.
Cellule Sec31-1 GhLag1 chì esprimenu secrezioni indotte da galattosio, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) è Mid2-iRFP (TMP, blu) è Sec13-mCherry marcatu cù ERES custitutivu (ERES, magenta). Incubà à 37°C. Continuà per 30 minuti, calà à 24°C per liberà e secrezioni, è imaghjinà cù SCLIM dopu à 20 minuti. (Da A à C) Immagini di pruiezione 2D rappresentative (A; barra di scala, 1μm) o immagini di l'emisferu cellulare 3D (B è C; unità di scala, 0,45μm) di e 10 sezioni z marcate da u cargu è ERES. U pannellu inferiore in (B) è u pannellu in (C) mostranu immagini trasfurmate per visualizà solu e merci presenti in ERES (magenta) [Gas1-GFP (grisgiu) è Mid2-iRFP (blu chjaru)]. (C) Freccia bianca piena: ERES, merci si sovrappongono. Freccia aperta: L'ERES cuntene solu un articulu. Pannellu inferiore: L'ERES sceltu hà merci sovrapposte (1 è 2) marcate in (C). Barra di scala, 100 nm. (D) Quantificazione di a microfotografia descritta in (C). In l'unità sec31-1 è sec31-1 GhLag1, hè inclusa solu una carica (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), è a percentuale media di ERES per a carica isolata è a carica sovrapposta. In trè esperimenti indipendenti, n = 432 in 54 cellule (sec31-1) è n = 430 in 47 cellule (sec31-1 GhLag1). Barra d'errore = SD. Test t spaiatu à duie code. *** P = 0,0002 (sec31-1) è ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imagine 3D di l'ERES sceltu cù carica sovrapposta (3) marcata in (C). Gas1-GFP (verde) è Mid2-iRFP (blu) s'avvicinanu à ERES (magenta) da u listessu latu è stanu in a listessa zona ristretta di ERES. Barra di scala, 100 nm.
Stu studiu furnisce evidenze dirette in vivo chì i carichi di proteine ​​à basa di lipidi sò classificati in siti d'esportazione selettivi in ​​a via secretoria, è rivela l'impurtanza di a lunghezza di a catena acilica per a selettività di classificazione. Usendu una tecnica di microscopia putente è d'avanguardia chjamata SCLIM, avemu dimustratu u Gas1-GFP appena sintetizatu (un GPI-AP maiò di a membrana plasmatica cù una porzione lipidica di ceramide à catena acilica (C26) assai longa) in u levitu). E regioni raggruppate in ER discreti sò assuciate à ERES specifici, mentre chì e proteine ​​secrete transmembrana sò distribuite in tutta a membrana ER (Figura 1). Inoltre, questi dui tipi di merci entranu selettivamente in diversi ERES (Figura 2). A lunghezza di a catena acilica di a ceramide cellulare in a membrana hè ridutta da C26 à C18-C16, u cluster Gas1-GFP hè interrottu in a regione ER discreta, è Gas1-GFP hè reindirizzatu per lascià l'ER cù a proteina transmembrana attraversu u listessu ERES (Figura 3 è Figura 3). 4).
Ancu s'è GPI-AP usa un mecanismu proteicu specializatu per esce da l'ER, avemu trovu chì a separazione dipendente da a ceramide C26 ùn si basa micca nantu à l'interazzione differenziale di e proteine ​​chì ponu purtà à a specializazione di l'ERES (Figure S4 è S5). Invece, i nostri risultati sustenenu un mecanismu di classificazione alternativu guidatu da u raggruppamentu di proteine ​​basatu nantu à i lipidi è a successiva esclusione di altri carichi. E nostre osservazioni indicanu chì a regione o u cluster Gas1-GFP assuciatu à un ERES specificu ùn hà micca a proteina secreta transmembrana Mid2-iRFP, ciò chì indica chì u cluster GPI-AP dipendente da a ceramide C26 faciliterà a so entrata in l'ERES pertinente, è à u listessu tempu, escluderà e secrezioni transmembrana. E secrezioni entranu in questu ERES particulare (Figure 1 è 2). In cuntrastu, a presenza di ceramidi C18-C16 in a membrana di l'ER ùn face micca chì GPI-AP formi regioni o cluster, dunque ùn escludenu o ùn rimpiazzanu micca e proteine ​​secrete transmembrana in u listessu ERES (Figure 3 è 4). Dunque, proposemu chì a ceramide C26 guida a separazione è a classificazione facilitendu u raggruppamentu di proteine ​​​​ligate à ERES specifici.
Cumu ottene questu raggruppamentu dipendente da a ceramide C26 in una zona specifica di u RE? A tendenza di a ceramide di membrana à separassi lateralmente pò causà a ceramide GPI-AP è C26 à furmà lipidi chjuchi è istantaneamente ordinati in l'ambiente lipidicu più irregulare di a membrana RE chì cuntene glicerolipidi più corti è insaturi. Gruppi di qualità (17, 18). Quessi picculi gruppi temporanei ponu esse ulteriormente fusi in gruppi più grandi è più stabili dopu u ligame à u cumplessu p24 (34). In cunfurmità cù questu, avemu dimustratu chì C26 Gas1-GFP hà bisognu di interagisce cù u cumplessu p24 per furmà gruppi visibili più grandi (Figura 3). U cumplessu p24 hè un oligomeru eterozigotu cumpostu da quattru diverse proteine ​​transmembrana p24 in u levitu (35), chì furnisce un ligame multivalente, chì pò purtà à u cross-linking di picculi gruppi GPI-AP, generendu cusì un gruppu stabile più grande (34). L'interazione trà l'ectodomini proteichi di GPI-AP pò ancu cuntribuisce à a so aggregazione, cum'è dimustratu durante u so trasportu di Golgi in e cellule epiteliali polarizzate di i mammiferi (36). Tuttavia, quandu a ceramide C18-C16 hè presente in a membrana ER, quandu u cumplessu p24 si lega à Gas1-GFP, ùn si formeranu micca grandi gruppi separati. U mecanismu sottostante pò dipende da e proprietà fisiche è chimiche specifiche di a ceramide à catena acilica longa. Studi biofisichi di membrane artificiali mostranu chì, ancu s'è e ceramidi à catena acilica longa (C24) è corta (C18-C16) ponu causà a separazione di fase, solu e ceramidi à catena acilica longa (C24) ponu prumove una alta curvatura è a piegatura di u film per rimodellà u film. Attraversu riferimentu mutuale (17, 37, 38). Hè statu dimustratu chì l'elica transmembrana di TMED2, l'omologu umanu di Emp24, interagisce selettivamente cù a sfingomielina basata nantu à a ceramide C18 in i lobuli citoplasmatici (39). Usendu simulazioni di dinamica moleculare (MD), avemu trovu chì e ceramidi C18 è C26 s'accumulanu intornu à i lobuli citoplasmatici di l'elica transmembrana Emp24, è anu preferenze simili (Figura S6). Vale a pena nutà chì questu indica chì l'elica transmembrana di Emp24 pò purtà à una distribuzione asimmetrica di lipidi in a membrana. Questu hè un risultatu recente basatu annantu à e cellule di mammiferi. Simulazioni MD simili mostranu ancu a presenza di lipidi eterei (40). Dunque, ipotemu chì a ceramide C26 in i dui lobuli di ER26 hè arricchita lucalmente. Quandu GPI-AP in i lobuli luminali si lega direttamente à p24 multivalente è l'accumulazione di ceramide C26 intornu à p24 in i lobuli citoplasmatici, pò prumove l'aggregazione di proteine ​​​​accumpagnanti è a curvatura di a membrana sò generate attraversu i diti (41), pruvucendu a separazione di GPI-AP in regioni discrete adiacenti à ERES, chì favurisce ancu e regioni altamente curve di a membrana ER (42). Rapporti precedenti anu sustinutu u mecanismu prupostu (43, 44). U ligame multivalente di oligolectine, patogeni o anticorpi à i glicosfingolipidi (GSL) à basa di ceramide nantu à a membrana plasmatica provoca una grande aggregazione GSL, migliora a separazione di fase è provoca a deformazione è l'internalizazione di a membrana (44). Iwabuchi ecc. (43) Hè statu trovu chì in presenza di catene aciliche lunghe (C24) ma micca corte (C16), u ligante multivalente ligatu à a lattosilceramide GSL hà induttu a furmazione di grandi gruppi è l'invaginazione di a membrana, è a trasduzione di u signale mediata da Lyn di u citoplasma nantu à i leaflet hè interdigitata da catene aciliche in neutrofili accoppiati.
In e cellule epiteliali polarizzate di i mammiferi, a cuncentrazione di a rete anti-Golgi (TGN) à u livellu di a membrana plasmatica apicale cuntrolla a separazione è a classificazione di GPI-AP (10, 45). Questa aggregazione hè guidata da l'oligomerizazione di GPI-AP (36), ma pò ancu dipende da a lunghezza di a catena di ceramide chì truvemu in u levitu. Ancu s'è u GPI-AP di i mammiferi hà un'ancora basata nantu à i lipidi eterei, è a so struttura chimica hè assai diversa da a ceramide à catena acilica assai longa, un studiu recente hà trovu chì i dui lipidi anu proprietà fisiche è chimiche è una funzione evolutivamente simili (40). Dunque, a parte lipidica eterea in e cellule di i mammiferi pò esse simile à a ceramide C26 in u levitu, è u so rolu hè di associassi cù a ceramide à catena longa in a membrana per prumove l'aggregazione è a classificazione di GPI-AP. Ancu s'è sta pussibilità deve ancu esse testata direttamente, i risultati precedenti sustenenu chì u trasportu di a ceramide à catena acilica longa à u corpu di Golgi ùn hè micca realizatu da proteine ​​di trasferimentu citoplasmatiche, ma dipende da a sintesi di ancore GPI cum'è u levitu. Dunque, u mecanismu cunservatore evolutivu pare esse capace di co-trasportà selettivamente ceramide à catena acilica assai longa è GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) in a stessa vescicula di trasportu.
In i sistemi di cellule epiteliali polarizzate di lievito è di mammiferi, l'aggregazione è a separazione di GPI-AP da altre proteine ​​di a membrana plasmatica si verificanu prima di ghjunghje à a superficia cellulare. Paladino et al. (48) anu trovu chì nantu à u TGN di e cellule epiteliali polarizzate di i mammiferi, u raggruppamentu di GPI-AP ùn hè micca solu necessariu per a classificazione selettiva di GPI-AP à a membrana plasmatica apicale, ma regula ancu l'urganizazione di raggruppamentu di GPI-AP è a so attività biologica. Superficie cellulare. In u lievito, questu studiu hà dimustratu chì u cluster GPI-AP dipendente da a ceramide C26 nantu à l'ER pò regulà l'urganizazione di i cluster è l'attività funzionale di GPI-AP nantu à a membrana plasmatica (24, 49). In cunfurmità cù questu mudellu, e cellule GhLag1 sò allergiche à l'inibitori di GPI o à i medicinali chì affettanu l'integrità di a parete cellulare (28), è a necessità di cluster Gas1-GFP funzionali (49) di a ceramide di punta prughjettata in l'accoppiamentu di e cellule di lievito indica G Possibili cunsequenze fisiologiche di e cellule hLag1. Errore GPI-AP. Tuttavia, ulteriori testi per verificà se l'urganizazione funzionale di a superficia cellulare hè stata prugrammata da u RE da un metudu di classificazione basatu annantu à a lunghezza di i lipidi saranu l'ughjettu di a nostra ricerca futura.
I ceppi di Saccharomyces cerevisiae utilizati in questu travagliu sò elencati in a Tavula S1. I ceppi MMY1583 è MMY1635 di SCLIM per l'imaghjini di cellule vive sò stati custruiti in u sfondate di W303. Quessi ceppi chì esprimenu Sec13-mCherry cù una etichetta di proteina fluorescente sò stati custruiti utilizendu un metudu basatu annantu à a reazione à catena di a polimerasi (PCR) cù u plasmide pFA6a cum'è mudellu (23). U ceppu chì esprime Mid2-iRFP marcatu cù a proteina fluorescente sottu u cuntrollu di u promotore GAL1 hè statu custruitu cum'è seguita. Amplificazione PCR di a sequenza iRFP-KanMx da u vettore pKTiRFP-KAN (rigalu di E. O'Shea, numeru di plasmide Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificatore di risorse di ricerca (RRID): Addgene_64687) È inseritu in u C-terminale di Mid2 endogenu. Dopu chì a sequenza di u genomu Mid2-iRFP hè stata amplificata è clonata in u promotore GAL1, hè stata integrata in u situ Not I-Sac I di u plasmide d'integrazione pRS306. U plasmide resultante pRGS7 hè statu linearizatu cù Pst I per integrà si in u locus URA3.
U genu di fusione Gas1-GFP hè espressu sottu u cuntrollu di u promotore GAL1 in u plasmide di u centromeru (CEN), chì hè custruitu cusì. A sequenza Gas1-GFP hè stata amplificata da PCR da u plasmide pRS416-GAS1-GFP (24) (rigalu di L. Popolo) è clonata in u situ Xma I-Xho I di u plasmide CEN pBEVY-GL LEU2 (rigalu di C). Miller; Numeru di plasmide Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). U plasmide risultante hè statu chjamatu pRGS6. U genu di fusione Axl2-GFP hè ancu espressu sottu u cuntrollu di u promotore GAL1 di u vettore pBEVY-GL LEU2, è a so custruzzione hè a seguente. A sequenza Axl2-GFP hè stata amplificata da u plasmide pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) per PCR, è clonata in u situ Bam HI-Pst I di u vettore pBEVY-GL LEU2. U plasmide risultante hè statu chjamatu pRGS12. A sequenza di l'oligonucleotidi utilizati in questu studiu hè elencata in a Tavula S2.
A ceppa hè stata supplementata cù 0,2% d'adenina è 2% di glucosiu [YP-destrosio (YPD)], 2% di raffinosi [YP-raffinosi], un mediu riccu in proteine ​​di estrattu di levitu (YP) (1% d'estrattu di levitu è ​​2% di proteine ​​ept). (YPR)] o 2% di galattosio [YP-galattosio (YPG)] cum'è fonte di carbone, o in un mediu sinteticu minimu (0,15% di basa azotata di levitu è ​​0,5% di sulfatu d'ammoniu) per supplementà l'aminoacidi è e basi apprupriate necessarie per a nutrizione, è cuntene 2% di glucosiu (mediu sinteticu minimu di glucosiu) o 2% di galattosio (mediu sinteticu minimu di galattosio) cum'è fonte di carbone.
Per l'imaghjini in tempu reale, e cellule mutanti sec31-1 sensibili à a temperatura chì esprimenu a custruzzione sottu à u promotore GAL1 sò state cultivate in mezu YPR à 24°C durante a notte finu à a fase media logaritmica. Dopu l'induzione in YPG à 24°C per 1 ora, e cellule sò state incubate in SG à 37°C per 30 minuti, è dopu trasferite à 24°C per esse liberate da u bloccu di secrezione. A concanavalina A hè stata aduprata per fissà e cellule nantu à un vetru è hè stata ripresa da SCLIM. SCLIM hè una cumbinazione di u microscopiu à fluorescenza inversa Olympus IX-71 è di a lente à oliu cù apertura numerica UPlanSApo 100 × 1,4 (Olympus), di un scanner cunfocale à discu rotante à alta velocità è à altu rapportu segnale-rumore (Yokogawa Electric), di un spettrometru persunalizatu è di un raffreddamentu persunalizatu. L'intensificatore d'immagine di u sistema (Hamamatsu Photonics) pò furnisce un sistema di lenti d'ingrandimentu cù un ingrandimentu finale di × 266,7 è una camera cù dispositivu à carica accoppiata chì multiplica l'elettroni (Hamamatsu Photonics) (21). L'acquisizione di l'immagine hè effettuata da un software persunalizatu (Yokogawa Electric). Per l'immagine 3D, avemu utilizatu un attuatore piezoelettricu fattu à misura per fà vibrà a lente obiettiva verticalmente, è avemu raccoltu e parti ottiche à 100 nm di distanza in una pila. L'immagine Z-stack hè cunvertita in dati voxel 3D, è a funzione teorica di diffusione di punti utilizata per u microscopiu cunfocale à discu rotante hè utilizata per l'elaborazione di deconvoluzione da u software Volocity (PerkinElmer). Utilizendu u software Volocity per automaticamente definisce a soglia per l'analisi di co-locazione, hè statu misuratu l'ERES, cumprese a carica. L'analisi di scansione lineare hè stata realizata utilizendu u software MetaMorph (Molecular Devices).
Aduprate u software GraphPad Prism per determinà a significatività statistica. Per u test t di Student à duie code è u test ordinariu di analisi di varianza à una via (ANOVA), e differenze trà i gruppi sò cunsiderate cum'è avendu un impattu significativu annantu à P <0,05 (*).
Per a microscopia à fluorescenza di Gas1-GFP, e cellule di fase logaritmica sò state cultivate durante a notte in YPD è raccolte per centrifugazione, lavate duie volte cù soluzione salina tamponata cù fosfatu, è incubate nantu à u ghjacciu per almenu 15 minuti, è dopu processate sottu à u microscopiu cum'è descrittu prima Check (24). U microscopiu Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) equipatu cù una lente obiettiva, un filtru L5 (GFP), una camera Hamamatsu è u software Application Suite X (LAS X) hè statu utilizatu per l'acquisizione.
I campioni sò stati denaturati cù un buffer di campione SDS à 65°C per 10 minuti, è dopu separati per elettroforesi in gel di poliacrilamide SDS (PAGE). Per l'analisi immunoblotting, 10 μl di campione sò stati caricati per corsia. Anticorpu primariu: Aduprà anti-Gas1 policlonale di cunigliu à una diluzione di 1:3000, anti-Emp24 policlonale di cunigliu à una diluzione di 1:500, è anti-GFP policlonale di cunigliu (un rigalu di H. Riezman) à una diluzione di 1:3000. L'anticorpu monoclonale di topo anti-Pgk1 hè statu adupratu à una diluzione di 1:5000 (un rigalu di J. de la Cruz). Anticorpu secundariu: Immunoglobulina G di capra anti-cunigliu (IgG) coniugata cù perossidasi di rafano (HRP) aduprata à una diluzione di 1:3000 (Pierce). L'IgG di capra anti-topo cuniugata cù HRP hè stata aduprata à una diluzione di 1:3000 (Pierce). A zona di risposta immune hè stata osservata cù u metudu di chemiluminescenza di u reagente SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Cum'è descrittu in (31), un esperimentu d'immunoprecipitazione naturale hè statu realizatu nantu à a frazione ER arricchita. In breve, lavate e cellule di levitu cù un buffer TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluoruru di fenilmetilsulfonile è una mistura d'inibitore di proteasi) à 600 nm (OD600) à una densità ottica di 100 duie volte. Hè statu rottu cù perle di vetru, è dopu i detriti cellulari è e perle di vetru sò stati rimossi per centrifugazione. U surnatante hè statu poi centrifugatu à 17.000 g per 15 minuti à 4 °C. U pellet hè statu risospesu in TNE è a saponina digitale hè stata aghjunta à una cuncentrazione finale di 1%. A sospensione hè stata incubata per 1 ora cù rotazione à 4 °C, è dopu i cumpunenti insolubili sò stati rimossi per centrifugazione à 13.000 g à 4 °C per 60 minuti. Per l'immunoprecipitazione Gas1-GFP, prima preincubate u campione cù perle d'agarosa viote (ChromoTek) à 4°C per 1 ora, è dopu incubate cù GFP-Trap_A (ChromoTek) à 4°C per 3 ore. E perle immunoprecipitate sò state lavate cinque volte cù TNE chì cuntene 0,2% digossigenina, eluite cù tampone di campione SDS, separate nantu à SDS-PAGE è analizate per immunoblotting.
Cum'è descrittu in (31), a determinazione di a reticolazione hè stata effettuata nantu à a frazione ER arricchita. In breve, a frazione ER arricchita hè stata incubata cù 0,5 mM di ditiobis(succinimidil propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). A reazione di reticolazione hè stata interrotta aghjunghjendu glicina (50 mM di cuncentrazione finale, 5 minuti, 20°C).
Cum'è descrittu prima (50), hè stata realizata l'analisi MS di a ceramide in ceppi di tipu salvaticu è GhLag1. In breve, e cellule sò state cultivate à fase esponenziale (da 3 à 4 unità OD600/ml) in YPD à 30°C, è 25×107 cellule sò state raccolte. U so metabolismu hè inattivatu cù l'acidu tricloroaceticu. Aduprate u solvente d'estrazione [etanolu, acqua, etere, piridina è idrossidu d'ammoniu 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] è 1,2 nmol di ceramide C17 standard internu (860517, Avanti polar lipid) di qualità). Aduprate u reagente di monometilammina [metanolo, acqua, n-butanolo è soluzione di metilammina (4:3:1:5 v/v)] per realizà una idrolisi alcalina lieve di l'estrattu, è dopu aduprate n-butanolo saturatu d'acqua per dissalà. Infine, l'estrattu hè statu risuspendu in un solvente in modu pusitivu [cloroformu/metanolu/acqua (2:7:1) + 5 mM acetatu d'ammoniu] è injectatu in u spettrometru di massa. U monitoraghju multi-reazione (MRM) hè statu realizatu per l'identificazione è a quantificazione di e molecule di sfingolipidi. U spettrometru di massa quadrupolo terziariu TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) hè dotatu di una fonte di ioni à nanoflussu robotica Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) per l'analisi di i lipidi. L'energia di collisione hè ottimizzata per ogni categuria di ceramide. I dati MS sò stati ottenuti in modu pusitivu. Per ogni replica biologica, u signale lipidicu hè a mediana di trè misurazioni indipendenti.
Cum'è descrittu in (31), e cellule (800 × 107) chì esprimenu Gas1-GFP sò state sottumesse à immunoprecipitazione naturale. U Gas1-GFP purificatu hè statu separatu da SDS-PAGE è trasferitu à una membrana di fluoruru di polivinilidene (PVDF). A proteina hè stata visualizata culurendu PVDF cù neru amide. A banda Gas1-GFP hè stata tagliata da u PVDF è lavata 5 volte cù metanolu è una volta cù acqua di qualità cromatografia liquida-MS (LC-MS). Incubendu a striscia di membrana cù 500 μl di NaOAc 0,3 M (pH 4,0), buffer è 500 μl di miscela di nitrito di sodiu 1 M appena dissolta à 37 °C per 3 ore, a frazione lipidica hè liberata da Gas1-GFP è lisata Liberazione di ceramide di fosfatu di inosina trà glucosamina è inositolo (51). Dopu à quessa, a striscia di membrana hè stata lavata quattru volte cù acqua di qualità LC-MS, asciugata à temperatura ambiente è cunservata in una atmosfera d'azotu à -80 °C finu à l'analisi. Cum'è cuntrollu, un campione biancu di membrana PVDF hè statu utilizatu per ogni esperimentu. U lipide estrattu da Gas1-GFP hè statu dopu analizatu da MS cum'è descrittu (50). In breve, e strisce PVDF chì cuntenenu GPI-lipide sò state risospese in 75 μl di solvente di muffa negativu [cloroformu / metanolu (1: 2) + 5 mM acetatu d'ammoniu] è sò state sottumesse à l'analisi di ionizazione elettrospray (ESI)-MRM / MS di e spezie di sfingolipidi (TSQ Vantage). In questu casu, i dati MS sò stati ottenuti in modalità ioni negativi.
Cum'è digià mintuvatu, a parte lipidica di l'ancora GPI hè stata separata da u GPI-AP marcatu cù [3H]-inositol (16). I lipidi sò stati separati per cromatografia à stratu sottile utilizendu un sistema di solvente (55:45:10 cloroformu-metanolo-0,25% KCl) è visualizati utilizendu FLA-7000 (Fujifilm).
E cellule chì esprimenu Gas1-GFP (600 × 107) sò state lavate duie volte cù buffer TNE cù buffer TNE, è rotte cù perle di vetru, è dopu centrifugate per rimuovere i detriti cellulari è e perle di vetru. U surnatante hè statu dopu centrifugatu à 17.000 g per 1 ora à 4 °C. U pellet hè statu lavatu in TNE è incubatu cù 1 U PI-PLC (Invitrogen) in TNE chì cuntene 0,2% di saponina digitale per 1 ora à 37 °C. Dopu u trattamentu enzimaticu, a membrana hè stata rimossa per centrifugazione à 17.000 g à 4 °C per 1 ora. Per immunoprecipità Gas1-GFP, u surnatante hè statu incubatu cù GFP-Trap_A (ChromoTek) à 4 °C per tutta a notte. U Gas1-GFP purificatu separatu da SDS-PAGE hè statu culuritu cù blu brillanti Coomassie. A banda di culurazione Gas1-GFP hè stata tagliata da u grisgiu chì circundava l'acquedottu, è dopu à l'alchilazione cù iodoacetamide è a riduzione cù ditiotreitolu, hè stata realizata a digestione in gel cù tripsina. Estrarre è seccà i peptidi triptici è i peptidi cù GPI-glicani. U peptide seccu hè statu dissoltu in 20 μl d'acqua. Iniettà una parte (8 μl) in u LC. Una colonna di ottadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diametru internu 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefettura di Aichi, Giappone) hè stata aduprata per separà i peptidi in cundizioni di gradiente specifiche. A fase mobile hè u solvente A (0,08% acidu formicu) è u solvente B (0,15% acidu formicu in 80% acetonitrile). Un sistema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) hè statu utilizatu per elue a colonna cù u solvente A in 55 minuti à un flussu di 50 μl min-1 per 5 minuti, è dopu a cuncentrazione di u solvente B hè stata aumentata à 40%. , Stati Uniti). L'eluatu hè statu introduttu continuamente in a fonte di ioni ESI, è i peptidi triptici è i peptidi cù GPI-glicani sò stati analizati da LTQ Orbitrap XL (spettrometru di massa ibridu lineare trappola di ioni-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). In a cunfigurazione MS, a tensione di a fonte capillare hè stata impostata à 4,5 kV, è a temperatura di u capillare di trasferimentu hè stata mantenuta à 300 °C. A tensione capillare è a tensione di a lente di u tubu sò state impostate rispettivamente à 15 V è 50 V. I dati MS sò stati ottenuti in u modu ionicu pusitivu (risoluzione di 60.000; precisione di massa di 10 parti per milione) in un intervallu di massa di 300/m/z rapportu massa/carica (m/z) 3000. I dati MS/MS sò ottenuti attraversu a trappula ionica in l'LTQ Orbitrap XL [i primi 3 cifri da i quali dipendenu i dati, dissociazione indotta da collisione (CID)].
E simulazioni MD sò state realizate cù u software GROMACS (52) è u campu di forza MARTINI 2 (53-55). U CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) hè statu tandu utilizatu per custruisce un doppiu stratu chì cuntene dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) è Cer C18 o DOPC è Cer C26. A topologia è e coordinate di Cer C26 sò derivate da DXCE eliminendu e perle extra da a coda di sfingosina. Aduprate u prucessu discrittu quì sottu per equilibrà u doppiu stratu è eseguisce lu, tandu utilizate l'ultime coordinate di u sistema per custruisce un sistema chì cuntene Emp24. U duminiu transmembrana di u levitu Emp24 (residui 173 à 193) hè statu custruitu cum'è una α-elica utilizendu a struttura moleculare di u strumentu visuale MD (VMD) (58). Dopu, dopu avè eliminatu i lipidi sovrapposti, a proteina hè stata granulata grossolanamente è inserita in u doppiu stratu utilizendu CHARMM GUI. U sistema finale cuntene 1202 DOPC è 302 Cer C26 o 1197 DOPC è 295 Cer C18 è Emp24. Ionizà u sistema à una cuncentrazione di 0,150 M. Quattru repliche indipendenti sò state fatte per duie cumpusizioni di doppiu stratu.
U doppiu stratu lipidicu hè equilibratu cù u prucessu CHARMM GUI, chì implica a minimizazione è dopu l'equilibrazione di 405.000 passi, induve i vincoli di pusizione sò gradualmente ridutti è eliminati, è u passu di tempu hè aumentatu da 0,005 ps à 0,02 ps. Dopu l'equilibrazione, produce 6 µs cù un passu di tempu di 0,02 ps. Dopu avè inseritu Emp24, aduprate u listessu prucessu CHARMM GUI per minimizà è equilibrà u sistema, è dopu eseguite per 8 s in pruduzzione.
Per tutti i sistemi, durante u prucessu di equilibriu, a pressione hè cuntrullata da u barostatu Berendsen (59), è durante u prucessu di pruduzzione, a pressione hè cuntrullata da u barostatu Parrinello-Rahman (60). In tutti i casi, a pressione media hè di 1 bar è si usa un schema di accoppiamentu di pressione semi-isotropicu. In u prucessu di equilibriu è di pruduzzione, un termostatu (61) cù ricalibrazione di velocità hè adupratu per accoppià a temperatura di e proteine, di i lipidi è di e particelle di solvente rispettivamente. Durante tutta l'operazione, a temperatura target hè di 310K. L'interazione senza legame hè calculata generendu una lista di accoppiamenti utilizendu u schema Verlet cù una tolleranza di buffer di 0,005. U termine Coulomb hè calculatu utilizendu u campu di reazione è una distanza di cut-off di 1,1 nm. U termine Vander Waals usa un schema di cut-off cù una distanza di cut-off di 1,1 nm, è u schema di cut-off di Verlet hè adupratu per a deriva potenziale (62).
Usendu VMD, a lunghezza d'onda di taglio trà e perle di fosfatu DOPC o e perle di ceramide AM1 è a proteina hè 0,7 nm, è u numeru di lipidi chì interagiscenu cù a proteina hè calculatu. Sicondu a formula seguente, calculate u fattore di deplezione-arricchimentu (DE) cum'è in (63): Fattore DE = (a quantità di lipidi totali in a proteina 0,7) in a proteina 0,7 (a quantità di Cer in i lipidi totali)
U valore riportatu hè ottenutu cum'è una media, è e barre d'errore sò quattru copie indipendenti di SE. A significatività statistica di u fattore DE hè calculata da u test t [(fattore DE mediu-1)/SE]. Calcula u valore P da a distribuzione à una coda.
U strumentu GROMACS hè statu utilizatu per calculà a mappa di densità laterale 2D di u sistema chì cuntene Emp24 in l'ultimi 250 ns di a traccia. Per ottene a mappa di arricchimentu/deplezione di ceramide, a mappa di densità di Cer hè divisa per a somma di a mappa di Cer è DOPC, è dopu divisa per a cuncentrazione di Cer in u corpu. A listessa scala di mappa di culore hè aduprata.
Per materiali supplementari per questu articulu, per piacè vede http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Questu hè un articulu d'accessu apertu distribuitu sottu i termini di a Licenza Creative Commons Attribution-Non-Commercial, chì permette l'usu, a distribuzione è a ripruduzzione in qualsiasi mezu, basta chì l'usu finale ùn sia micca per un guadagnu cummerciale è a premessa sia chì l'opera originale sia curretta. Riferimentu.
Nota: Vi dumandemu solu di furnisce u vostru indirizzu email affinchì a persona chì ricumandate à a pagina sappia chì vulete ch'ella veda l'email è chì ùn hè micca spam. Ùn cattureremu micca indirizzi email.
Sta quistione hè aduprata per verificà s'è vo site un visitatore è impedisce l'inviu automaticu di spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Misko Waman (Sergio Lopez), Miho Waga (Misko Waga), Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L'imaghjini 3D in tempu reale à alta risoluzione rivelanu l'impurtanza di a lunghezza di a catena di ceramide per l'urdinamentu di e proteine ​​in i siti di output selettivi.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Misko Waman (Sergio Lopez), Miho Waga (Misko Waga), Miho Waga Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L'imaghjini 3D in tempu reale à alta risoluzione rivelanu l'impurtanza di a lunghezza di a catena di ceramide per l'urdinamentu di e proteine ​​in i siti di output selettivi.
© 2020 Associazione Americana per l'Avanzamentu di a Scienza. tutti i diritti riservati. AAAS hè un cumpagnu di HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef è COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.