Avemu digià signalatu chì i livelli sierichi di u metabolitu di u triptofanu derivatu da l'intestinu, l'acidu indole-3-propionicu (IPA), sò più bassi in i pazienti cun fibrosi epatica. In questu studiu, avemu investigatu u trascrittoma è u metiloma di u DNA in i fegati obesi in relazione à i livelli sierichi di IPA, è ancu u rolu di l'IPA in l'induzione di l'inattivazione fenotipica di e cellule stellate epatiche (HSC) in vitro.
U studiu hà inclusu 116 pazienti obesi senza diabete mellitus di tipu 2 (T2DM) (età 46,8 ± 9,3 anni; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) chì sò stati sottumessi à chirurgia bariatrica à u Centru di Chirurgia Bariatrica di Kuopio (KOBS). I livelli circulanti di IPA sò stati misurati per cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), l'analisi di u trascrittoma di u fegatu hè stata realizata per sequenziamentu tutale di l'RNA, è l'analisi di metilazione di u DNA hè stata realizata utilizendu l'Infinium HumanMethylation450 BeadChip. E cellule stellate epatiche umane (LX-2) sò state aduprate per esperimenti in vitro.
I livelli sierichi di IPA eranu currelati cù l'espressione di geni implicati in e vie apoptotiche, mitofagiche è di longevità in u fegatu. U genu AKT serina/treonina chinasi 1 (AKT1) era u genu interagente u più abbundante è dominante in i profili di trascrizione epatica è di metilazione di u DNA. U trattamentu IPA hà induttu l'apoptosi, hà diminuitu a respirazione mitocondriale è hà alteratu a morfologia cellulare è a dinamica mitocondriale modulendu l'espressione di geni cunnisciuti per regulà a fibrosi, l'apoptosi è a sopravvivenza di e cellule LX-2.
Pigliati inseme, sti dati sustenenu chì l'IPA hà effetti terapeutici putenziali è pò induce l'apoptosi è spustà u fenotipu HSC versu un statu inattivu, allargendu cusì a pussibilità di inibisce a fibrosi epatica interferendu cù l'attivazione di HSC è u metabolismu mitocondriale.
A prevalenza di l'obesità è di a sindrome metabolica hè stata assuciata à una incidenza crescente di steatosi epatica assuciata à u metabolismo (MASLD); a malatia affetta da u 25% à u 30% di a pupulazione generale [1]. A principale cunsequenza di l'etiologia di a MASLD hè a fibrosi epatica, un prucessu dinamicu carattarizatu da l'accumulazione cuntinua di matrice extracellulare fibrosa (ECM) [2]. E principali cellule implicate in a fibrosi epatica sò e cellule stellate epatiche (HSC), chì presentanu quattru fenotipi cunnisciuti: quiescenti, attivate, inattivate è senescenti [3, 4]. L'HSC ponu esse attivate è transdifferenziassi da una forma quiescente in cellule proliferative simili à fibroblasti cù elevate esigenze energetiche, cù una maggiore espressione di α-actina di u musculu lisciu (α-SMA) è collagene di tipu I (Col-I) [5, 6]. Durante l'inversione di a fibrosi epatica, l'HSC attivate sò eliminate per apoptosi o inattivazione. Questi prucessi includenu a downregulation di i geni fibrogenici è a modulazione di i geni di prosopravvivenza (cum'è e vie di segnalazione NF-κB è PI3K/Akt) [7, 8], è ancu cambiamenti in a dinamica è a funzione mitocondriale [9].
I livelli sierichi di u metabolitu di u triptofanu, l'acidu indole-3-propionicu (IPA), pruduttu in l'intestinu, sò stati trovati diminuiti in e malatie metaboliche umane, cumprese a MASLD [10-13]. L'IPA hè assuciatu à l'assunzione di fibre alimentari, hè cunnisciutu per i so effetti antioxidanti è antiinflamatori, è attenua u fenotipu di steatoepatite non alcolica (NASH) indotta da a dieta in vivo è in vitro [11-14]. Alcune evidenze venenu da u nostru studiu precedente, chì hà dimustratu chì i livelli sierichi di IPA eranu più bassi in i pazienti cun fibrosi epatica chè in i pazienti obesi senza fibrosi epatica in u Studiu di Chirurgia Bariatrica di Kuopio (KOBS). Inoltre, avemu dimustratu chì u trattamentu cù IPA puderia riduce l'espressione di geni chì sò marcatori classici di adesione cellulare, migrazione cellulare è attivazione di e cellule staminali ematopoietiche in un mudellu di cellule stellate epatiche umane (LX-2) è hè un putenziale metabolitu epatoprotettivu [15]. Tuttavia, ùn hè micca chjaru cumu l'IPA induce a regressione di a fibrosi epatica attivendu l'apoptosi di HSC è a bioenergetica mitocondriale.
Quì, dimustremu chì l'IPA siericu hè assuciatu à l'espressione di geni arricchiti in apoptosi, mitofagia è vie di longevità in u fegatu di individui obesi ma senza diabete di tipu 2 (KOBS). Inoltre, avemu trovu chì l'IPA pò induce l'eliminazione è a degradazione di e cellule staminali ematopoietiche attivate (HSC) via a via di inattivazione. Quessi risultati rivelanu un novu rolu per l'IPA, chì ne face un potenziale bersagliu terapeuticu per prumove a regressione di a fibrosi epatica.
Un studiu precedente in a coorte KOBS hà dimustratu chì i pazienti cun fibrosi epatica avianu livelli di IPA circulante più bassi paragunatu à i pazienti senza fibrosi epatica [15]. Per escludere u putenziale effettu cunfundente di u diabete di tipu 2, avemu reclutatu 116 pazienti obesi senza diabete di tipu 2 (età media ± SD: 46,8 ± 9,3 anni; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tavula 1) da u studiu KOBS in corsu cum'è pupulazione di studiu [16]. Tutti i participanti anu datu u so accunsentu infurmatu scrittu è u protocolu di studiu hè statu appruvatu da u Cumitatu Eticu di l'Ospedale di a Contea di North Savo in cunfurmità cù a Dichjarazione di Helsinki (54/2005, 104/2008 è 27/2010).
I campioni di biopsia epatica sò stati ottenuti durante a chirurgia bariatrica è valutati istologicamente da patologi esperti secondu i criteri descritti prima [17, 18]. I criteri di valutazione sò riassunti in a Tabella Supplementare S1 è sò stati descritti prima [19].
I campioni di serumu à digiunu sò stati analizati per cromatografia liquida senza target-spettrometria di massa (LC-MS) per l'analisi metabolomica (n = 116). I campioni sò stati analizati utilizendu un sistema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germania) cum'è descrittu prima19. L'identificazione di l'alcol isopropilicu (IPA) hè stata basata annantu à u tempu di ritenzione è a paragone di u spettru MS/MS cù standard puri. L'intensità di u signale IPA (area di piccu) hè stata cunsiderata in tutte l'analisi successive [20].
U sequenziamentu di l'ARN di u fegatu sanu hè statu realizatu cù Illumina HiSeq 2500 è i dati sò stati preprocessati cum'è descrittu prima [19, 21, 22]. Avemu realizatu analisi di espressione differenziale mirata di trascritti chì affettanu a funzione/biogenesi mitocondriale utilizendu 1957 geni selezziunati da a basa di dati MitoMiner 4.0 [23]. L'analisi di metilazione di u DNA di u fegatu hè stata realizata utilizendu l'Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) utilizendu a stessa metodologia cum'è descritta prima [24, 25].
E cellule stellate epatiche umane (LX-2) sò state gentilmente furnite da u prufessore Stefano Romeo è sò state cultivate è mantenute in mezu DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Per selezziunà a dosa di travagliu di IPA, e cellule LX-2 sò state trattate cù diverse concentrazioni di IPA (10 μM, 100 μM è 1 mM; Sigma, 220027) in mezu DMEM/F12 per 24 ore. Inoltre, per investigà a capacità di IPA di inattivà e HSC, e cellule LX-2 sò state co-trattate cù 5 ng/ml di TGF-β1 (sistemi R&D, 240-B-002/CF) è 1 mM di IPA in mezu senza serum per 24 ore. Per i cuntrolli di veiculu currispondenti, 4 nM HCL chì cuntene 0,1% BSA hè statu utilizatu per u trattamentu TGF-β1 è 0,05% DMSO hè statu utilizatu per u trattamentu IPA, è tramindui sò stati utilizati inseme per u trattamentu cumminatu.
L'apoptosi hè stata valutata cù u Kit di Rilevazione di l'Apoptosi FITC Annexin V cù 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) secondu l'istruzzioni di u fabricatore. In breve, LX-2 (1 × 105 cellule/pozzetto) sò state cultivate durante a notte in piastre à 12 pozzetti è poi trattate cù dosi multiple di IPA o IPA è TGF-β1. U ghjornu dopu, e cellule flottanti è aderenti sò state raccolte, tripsinizzate, lavate cù PBS, risospese in tampone di legame Annexin V è incubate cù FITC-Annexin V è 7-AAD per 15 minuti.
I mitocondri in e cellule viventi sò stati culuriti per l'attività ossidativa aduprendu Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Per i saggi MTR, e cellule LX-2 sò state incubate à densità uguali cù IPA è TGF-β1. Dopu à 24 ore, e cellule viventi sò state tripsinizzate, lavate cù PBS, è dopu incubate cù 100 μM MTR in un mezu senza serum à 37 °C per 20 minuti cum'è descrittu prima [26]. Per l'analisi di a morfologia di e cellule vive, a dimensione di e cellule è a cumplessità citoplasmatica sò state analizate aduprendu rispettivamente i parametri di scattering direttu (FSC) è di scattering laterale (SSC).
Tutti i dati (30 000 eventi) sò stati acquistati cù NovoCyte Quanteon (Agilent) è analizati cù u software NovoExpress® 1.4.1 o FlowJo V.10.
U tassu di cunsumu d'ossigenu (OCR) è u tassu d'acidificazione extracellulare (ECAR) sò stati misurati in tempu reale aduprendu un Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipatu cù un Seahorse XF Cell Mito Stress secondu l'istruzzioni di u fabricatore. In breve, 2 × 104 cellule LX-2/pozzettu sò state seminate nantu à piastre di cultura cellulare XF96. Dopu l'incubazione di una notte, e cellule sò state trattate cù isopropanolu (IPA) è TGF-β1 (Metodi Supplementari 1). L'analisi di i dati hè stata realizata aduprendu u software Seahorse XF Wave, chì include u Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Da questu, hè statu calculatu un Indice di Salute Bioenergetica (BHI) [27].
L'ARN tutale hè statu trascrittu in cDNA. Per i metudi specifichi, vede a riferenza [15]. I livelli di mRNA di a proteina acida ribosomiale umana 60S P0 (RPLP0) è di a ciclofilina A1 (PPIA) sò stati utilizati cum'è cuntrolli genetichi custitutivi. U sistema PCR in tempu reale QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Paesi Bassi) hè statu utilizatu cù u kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) o u kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), è u fold di l'espressione genica relativa hè statu calculatu utilizendu i parametri di ciclazione di u valore Ct cumparativu (ΔΔCt) è u metudu ∆∆Ct. I dettagli di i primer sò furniti in e Tabelle Supplementari S2 è S3.
L'ADN nucleare (ncDNA) è l'ADN mitocondriale (mtDNA) sò stati estratti cù u kit DNeasy blood and tissue (Qiagen) cum'è descrittu prima [28]. A quantità relativa di mtDNA hè stata calculata calculendu u rapportu di ogni regione di mtDNA bersagliu à a media geometrica di e trè regioni di DNA nucleare (mtDNA/ncDNA), cum'è detallatu in i Metodi Supplementari 2. I dettagli di i primer per mtDNA è ncDNA sò furniti in a Tabella Supplementare S4.
E cellule vive sò state culurite cù Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) per visualizà e rete mitocondriali intercellulari è intracellulari. E cellule LX-2 (1 × 104 cellule/pozzetto) sò state cultivate nantu à vetrini in piastre di cultura à fondu di vetru currispondenti (Ibidi GmbH, Martinsried, Germania). Dopu à 24 ore, e cellule LX-2 vive sò state incubate cù 100 μM MTR per 20 minuti à 37 °C è i nuclei cellulari sò stati culurati cù DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) cum'è descrittu prima [29]. E rete mitocondriali sò state visualizate utilizendu un microscopiu inversu Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germania) equipatu cù un modulu cunfocale Zeiss LSM 800 à 37 °C in una atmosfera umidificata cù 5% CO2 utilizendu un obiettivu 63×NA 1.3. Avemu acquistatu dece immagini di a serie Z per ogni tipu di campione. Ogni serie Z cuntene 30 sezioni, ognuna cù un spessore di 9,86 μm. Per ogni campione, l'imagine di dece campi di vista diversi sò state acquistate cù u software ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germania), è l'analisi di a morfologia mitocondriale hè stata realizata cù u software ImageJ (v1.54d) [30, 31] secondu i parametri dettagliati in i Metodi Supplementari 3.
E cellule sò state fissate cù 2% di glutaraldeide in un buffer fosfatu 0.1 M, seguitate da una fissazione cù una soluzione di tetrossidu d'osmiu à 1% (Sigma Aldrich, MO, USA), disidratate gradualmente cù acetone (Merck, Darmstadt, Germania), è infine incluse in resina epossidica. E sezioni ultrasottili sò state preparate è colorate cù 1% d'acetatu d'uranile (Merck, Darmstadt, Germania) è 1% di citratu di piombu (Merck, Darmstadt, Germania). L'imaghjini ultrastrutturali sò state ottenute aduprendu un microscopiu elettronicu à trasmissione JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Giappone) à una tensione d'accelerazione di 80 kV.
A morfologia di e cellule LX-2 trattate cù IPA per 24 ore hè stata analizata per microscopia à cuntrastu di fase à un ingrandimentu di 50x utilizendu un microscopiu à luce inversa Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 è AxioCam MRm, Jena, Germania).
I dati clinichi sò stati espressi cum'è media ± deviazione standard o mediana (intervallu interquartile: IQR). L'analisi di varianza à una via (variabili continue) o u test χ² (variabili categoriali) sò stati aduprati per paragunà e differenze trà i trè gruppi di studiu. U tassu di falsi pusitivi (FDR) hè statu adupratu per curregge i testi multipli, è i geni cù FDR < 0,05 sò stati cunsiderati statisticamente significativi. L'analisi di currelazione di Spearman hè stata aduprata per currelà a metilazione di u DNA CpG cù l'intensità di u signale IPA, cù valori p nominali (p < 0,05) riportati.
L'analisi di e vie hè stata realizata aduprendu un strumentu d'analisi di l'insemi di geni basatu annantu à u web (WebGestalt) per 268 trascritti (p nominale < 0,01), 119 trascritti assuciati à i mitocondri (p nominale < 0,05), è 4350 CpG trà 3093 trascritti epatici chì eranu assuciati à i livelli di IPA in u sieru circulante. U strumentu Venny DB (versione 2.1.0) dispunibule gratuitamente hè statu utilizatu per truvà geni sovrapposti, è StringDB (versione 11.5) hè statu utilizatu per visualizà l'interazioni proteina-proteina.
Per l'esperimentu LX-2, i campioni sò stati testati per a nurmalità aduprendu u test D'Agostino-Pearson. I dati sò stati ottenuti da almenu trè repliche biologiche è sottumessi à ANOVA à una via cù u test post hoc di Bonferroni. Un valore p inferiore à 0,05 hè statu cunsideratu statisticamente significativu. I dati sò presentati cum'è media ± SD, è u numeru di esperimenti hè indicatu in ogni figura. Tutte l'analisi è i grafichi sò stati realizati aduprendu u software statisticu GraphPad Prism 8 per Windows (GraphPad Software Inc., versione 8.4.3, San Diego, USA).
Prima, avemu investigatu l'associazione di i livelli sierichi di IPA cù i trascritti di u fegatu, di u corpu sanu è di a mitocondria. In u prufilu di trascritti tutale, u genu u più forte assuciatu cù i livelli sierichi di IPA era MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; protein kinase attivata da mitogeni - protein kinase 3 attivata da mitocondri); in u prufilu di trascritti ligatu à i mitocondri, u genu assuciatu u più forte era AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serina/treonina kinase 1) (File supplementariu 1 è File supplementariu 2).
Avemu dopu analizatu i trascritti glubali (n = 268; p < 0,01) è i trascritti assuciati à i mitocondri (n = 119; p < 0,05), identificendu infine l'apoptosi cum'è a via canonica più significativa (p = 0,0089). Per i trascritti mitocondriali assuciati à i livelli sierichi di IPA, ci simu cuncentrati nantu à l'apoptosi (FDR = 0,00001), a mitofagia (FDR = 0,00029) è e vie di segnalazione TNF (FDR = 0,000006) (Figura 1A, Tabella 2, è Figure Supplementari 1A-B).
Analisi sovrapposta di trascritti globali, assuciati à i mitocondri, è metilazione di u DNA in u fegatu umanu in associazione cù i livelli sierichi di IPA. A rapprisenta 268 trascritti globali, 119 trascritti assuciati à i mitocondri, è trascritti metilati di DNA chì sò mappati à 3092 siti CpG assuciati à i livelli sierichi di IPA (valori p < 0,01 per trascritti globali è DNA metilatu, è valori p < 0,05 per trascritti mitocondriali). I principali trascritti sovrapposti sò mostrati in u mezu (AKT1 è YKT6). B A mappa d'interazione di i 13 geni cù u puntu d'interazione più altu (0,900) cù altri geni hè stata custruita da i 56 geni sovrapposti (regione di linea nera) chì eranu significativamente assuciati à i livelli sierichi di IPA utilizendu u strumentu in linea StringDB. Verde: Geni mappati à u cumpunente cellulare Gene Ontology (GO): mitocondri (GO: 0005739). AKT1 hè a proteina cù u puntuatu u più altu (0.900) per l'interazzione cù altre proteine ​​basate nantu à i dati (basatu annantu à a minera di testu, esperimenti, basi di dati è coespressione). I nodi di a rete rapprisentanu e proteine, è i bordi rapprisentanu e cunnessione trà e proteine.
Siccomu i metaboliti di a microbiota intestinale ponu regulà a cumpusizione epigenetica per via di a metilazione di u DNA [32], avemu investigatu se i livelli sierichi di IPA eranu assuciati à a metilazione di u DNA di u fegatu. Avemu trovu chì i dui siti principali di metilazione assuciati à i livelli sierichi di IPA eranu vicinu à a regione 3 ricca di prolina-serina (C19orf55) è à u membru 6 (picculu) di a famiglia di proteine ​​di shock termicu B (HSPB6) (File supplementariu 3). A metilazione di u DNA di 4350 CpG (p < 0,01) era correlata cù i livelli sierichi di IPA è era arricchita in e vie regulatorie di a longevità (p = 0,006) (Figura 1A, Tabella 2, è Figura Supplementare 1C).
Per capisce i miccanismi biologichi chì sò à a basa di l'associazioni trà i livelli sierichi di IPA, i trascritti glubali, i trascritti assuciati à i mitocondri è a metilazione di u DNA in u fegatu umanu, avemu realizatu un'analisi di sovrapposizione di i geni identificati in l'analisi di e vie precedente (Figura 1A). I ​​risultati di l'analisi di l'arricchimentu di e vie di i 56 geni sovrapposti (drentu à a linea nera in a Figura 1A) anu dimustratu chì a via di l'apoptosi (p = 0,00029) hà evidenziatu dui geni cumuni à e trè analisi: AKT1 è YKT6 (omologu YKT6 v-SNARE), cum'è mostratu in u diagramma di Venn (Figura Supplementare 2 è Figura 1A). Hè interessante nutà chì avemu trovu chì AKT1 (cg19831386) è YKT6 (cg24161647) eranu pusitivamente correlati cù i livelli sierichi di IPA (File supplementariu 3). Per identificà e potenziali interazioni proteiche trà i prudutti genichi, avemu sceltu 13 geni cù u puntuatu di regione cumuna più altu (0,900) trà 56 geni sovrapposti cum'è input è avemu custruitu una mappa di interazione. Sicondu u livellu di fiducia (fiducia marginale), u genu AKT1 cù u puntuatu u più altu (0,900) era in cima (Figura 1B).
Basatu annantu à l'analisi di a via, avemu trovu chì l'apoptosi era a via principale, dunque avemu investigatu se u trattamentu IPA averebbe influenzatu l'apoptosi di HSC in vitro. Avemu dimustratu prima chì diverse dosi di IPA (10 μM, 100 μM è 1 mM) ùn eranu micca tossiche per e cellule LX-2 [15]. Questu studiu hà dimustratu chì u trattamentu IPA à 10 μM è 100 μM hà aumentatu u numeru di cellule viabili è necrotiche. Tuttavia, paragunatu à u gruppu di cuntrollu, a viabilità cellulare hè diminuita à una cuncentrazione di 1 mM di IPA, mentre chì u tassu di necrosi cellulare hè rimasu invariatu (Figura 2A, B). In seguitu, per truvà a cuncentrazione ottima per induce l'apoptosi in e cellule LX-2, avemu testatu 10 μM, 100 μM è 1 mM di IPA per 24 ore (Figura 2A-E è Figura Supplementare 3A-B). Curiosamente, IPA 10 μM è 100 μM anu diminuitu u tassu di apoptosi (%), ma IPA 1 mM hà aumentatu l'apoptosi tardiva è u tassu di apoptosi (%) paragunatu à u cuntrollu è hè statu dunque sceltu per ulteriori esperimenti (Figure 2A-D).
L'IPA induce l'apoptosi di e cellule LX-2. U metudu di doppia colorazione cù l'annexina V è u 7-AAD hè statu utilizatu per quantificà u ritmu apoptoticu è a morfologia cellulare per citometria di flussu. E cellule BA sò state incubate cù 10 μM, 100 μM è 1 mM IPA per 24 ore o cù F-H TGF-β1 (5 ng/ml) è 1 mM IPA in un mezu senza serum per 24 ore. A: cellule viventi (Annessina V -/ 7AAD-); B: cellule necrotiche (Annessina V -/ 7AAD+); C, F: precoce (Annessina V +/ 7AAD-); D, G: tardivu (Annessina V+/7AAD.+); E, H: percentuale di cellule apoptotiche totali precoci è tardive in ritmu apoptoticu (%). I dati sò espressi cum'è media ± SD, n = 3 esperimenti indipendenti. I paraguni statistici sò stati realizati utilizendu ANOVA à una via cù u test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Cum'è avemu dimustratu prima, 5 ng/ml di TGF-β1 pò induce l'attivazione di HSC aumentendu l'espressione di i geni marcatori classici [15]. E cellule LX-2 sò state trattate cù 5 ng/ml di TGF-β1 è 1 mM di IPA in cumbinazione (Fig. 2E-H). U trattamentu cù TGF-β1 ùn hà micca cambiatu u tassu di apoptosi, ma u cotrattamentu cù IPA hà aumentatu l'apoptosi tardiva è u tassu di apoptosi (%) paragunatu à u trattamentu cù TGF-β1 (Fig. 2E-H). Quessi risultati indicanu chì 1 mM di IPA pò prumove l'apoptosi in e cellule LX-2 indipendentemente da l'induzione di TGF-β1.
Avemu ancu investigatu l'effettu di l'IPA nantu à a respirazione mitocondriale in e cellule LX-2. I risultati anu dimustratu chì 1 mM IPA hà diminuitu i parametri di u tassu di cunsumu d'ossigenu (OCR): respirazione non mitocondriale, respirazione basale è massimale, perdita di protoni è pruduzzione di ATP paragunatu à u gruppu di cuntrollu (Figura 3A, B), mentre chì l'indice di salute bioenergetica (BHI) ùn hè micca cambiatu.
L'IPA riduce a respirazione mitocondriale in e cellule LX-2. A curva di respirazione mitocondriale (OCR) hè presentata cum'è parametri di respirazione mitocondriale (respirazione non mitocondriale, respirazione basale, respirazione massima, perdita di protoni, generazione di ATP, SRC è BHI). E cellule A è B sò state incubate cù 10 μM, 100 μM è 1 mM IPA per 24 ore, rispettivamente. E cellule C è D sò state incubate cù TGF-β1 (5 ng/ml) è 1 mM IPA in un mezu senza serum per 24 ore, rispettivamente. Tutte e misurazioni sò state nurmalizate à u cuntenutu di DNA utilizendu u kit CyQuant. BHI: indice di salute bioenergetica; SRC: capacità di riserva respiratoria; OCR: tasso di cunsumu d'ossigenu. I dati sò presentati cum'è media ± deviazione standard (SD), n = 5 esperimenti indipendenti. I paraguni statistici sò stati realizati utilizendu ANOVA à una via è test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; è ***p < 0,001
Per ottene una cunniscenza più cumpleta di l'effettu di l'IPA nantu à u prufilu bioenergeticu di e cellule LX-2 attivate da TGF-β1, avemu analizatu a fosforilazione ossidativa mitocondriale per OCR (Fig. 3C,D). I risultati anu dimustratu chì u trattamentu TGF-β1 puderia riduce a respirazione massima, a capacità di riserva respiratoria (SRC) è u BHI paragunatu à u gruppu di cuntrollu (Fig. 3C,D). Inoltre, u trattamentu cumminatu hà diminuitu a respirazione basale, a perdita di protoni è a pruduzzione di ATP, ma SRC è BHI eranu significativamente più alti di quelli trattati cù TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Avemu ancu realizatu u "Test di Fenotipu di l'Energia Cellulare" furnitu da u software Seahorse (Fig. Supplementare 4A-D). Cum'è mostratu in a Fig. Supplementare 3B, i putenziali metabolichi OCR è ECAR sò stati diminuiti dopu u trattamentu TGF-β1, ma ùn hè stata osservata alcuna differenza in i gruppi di trattamentu cumminatu è IPA paragunatu à u gruppu di cuntrollu. Inoltre, i livelli basali è di stress di OCR sò stati diminuiti dopu u trattamentu cumminatu è IPA paragunatu à u gruppu di cuntrollu (Fig. Supplementare 4C). Hè interessante nutà chì un mudellu simile hè statu osservatu cù a terapia cumminata, induve ùn hè statu osservatu alcun cambiamentu in i livelli basali è di stress di ECAR paragunatu à u trattamentu TGF-β1 (Fig. Supplementare 4C). In e HSC, a riduzione di a fosforilazione ossidativa mitocondriale è a capacità di u trattamentu cumminatu di restaurà SCR è BHI dopu l'esposizione à u trattamentu TGF-β1 ùn anu micca alteratu u putenziale metabolicu (OCR è ECAR). Pigliati inseme, sti risultati indicanu chì l'IPA pò riduce a bioenergetica in l'HSC, ciò chì suggerisce chì l'IPA pò induce un prufilu energeticu più bassu chì sposta u fenotipu HSC versu l'inattivazione (Figura Supplementare 4D).
L'effettu di l'IPA nantu à a dinamica mitocondriale hè statu investigatu aduprendu a quantificazione tridimensionale di a morfologia mitocondriale è di e cunnessione di rete, è ancu a culurazione MTR (Figura 4 è Figura Supplementare 5). A Figura 4 mostra chì, paragunatu à u gruppu di cuntrollu, u trattamentu TGF-β1 hà diminuitu a superficia media, u numeru di rami, a lunghezza tutale di i rami è u numeru di giunzioni di i rami (Figura 4A è B) è hà cambiatu a proporzione di mitocondri da morfologia sferica à intermedia (Figura 4C). Solu u trattamentu IPA hà diminuitu u vulume mitocondriale mediu è hà cambiatu a proporzione di mitocondri da morfologia sferica à intermedia paragunatu à u gruppu di cuntrollu (Figura 4A). In cuntrastu, a sfericità, a lunghezza media di i rami è l'attività mitocondriale valutate da MTR dipendente da u putenziale di membrana mitocondriale (Figura 4A è E) sò rimaste invariate è questi parametri ùn anu micca differitu trà i gruppi. Pigliati inseme, questi risultati suggerenu chì u trattamentu TGF-β1 è IPA parenu modulà a forma è a dimensione mitocondriale, è ancu a cumplessità di a rete in e cellule LX-2 viventi.
L'IPA altera a dinamica mitocondriale è l'abbundanza di DNA mitocondriale in e cellule LX-2. A. Imagine cunfocali rappresentative di cellule LX-2 vive incubate cù TGF-β1 (5 ng/ml) è 1 mM IPA per 24 ore in un mezu senza serum chì mostranu e rete mitocondriali colorate cù Mitotracker™ Red CMXRos è i nuclei colorati di blu cù DAPI. Tutti i dati cuntenenu almenu 15 imagine per gruppu. Avemu acquistatu 10 imagine Z-stack per ogni tipu di campione. Ogni sequenza di l'asse Z cuntene 30 fette, ognuna cù un spessore di 9,86 μm. Barra di scala: 10 μm. B. Oggetti rappresentativi (solu mitocondri) identificati applicendu a sogliatura adattiva à l'imagine. L'analisi quantitativa è a paragone di e cunnessione di rete morfologiche mitocondriali sò state realizate per tutte e cellule di ogni gruppu. C. Frequenza di i rapporti di forma mitocondriale. I valori vicini à 0 indicanu forme sferiche, è i valori vicini à 1 indicanu forme filamentose. D U cuntenutu di DNA mitocondriale (mtDNA) hè statu determinatu cum'è descrittu in Materiali è Metodi. L'analisi E Mitotracker™ Red CMXRos hè stata realizata per citometria di flussu (30 000 eventi) cum'è descrittu in Materiali è Metodi. I dati sò presentati cum'è media ± SD, n = 3 esperimenti indipendenti. I paraguni statistici sò stati realizati utilizendu ANOVA à una via è test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Avemu dopu analizatu u cuntenutu di mtDNA in e cellule LX-2 cum'è indicatore di u numeru mitocondriale. In paragone cù u gruppu di cuntrollu, u cuntenutu di mtDNA hè statu aumentatu in u gruppu trattatu cù TGF-β1 (Figura 4D). In paragone cù u gruppu trattatu cù TGF-β1, u cuntenutu di mtDNA hè statu diminuitu in u gruppu di trattamentu cumminatu (Figura 4D), ciò chì suggerisce chì l'IPA pò riduce u cuntenutu di mtDNA è forse u numeru mitocondriale è ancu a respirazione mitocondriale (Figura 3C). Inoltre, l'IPA pare riduce u cuntenutu di mtDNA in u trattamentu cumminatu, ma ùn hà micca affettatu l'attività mitocondriale mediata da MTR (Figure 4A-C).
Avemu investigatu l'associazione di IPA cù i livelli di mRNA di geni assuciati à a fibrosi, l'apoptosi, a sopravvivenza è a dinamica mitocondriale in e cellule LX-2 (Figura 5A-D). In paragone cù u gruppu di cuntrollu, u gruppu trattatu cù TGF-β1 hà mostratu una maggiore espressione di geni cum'è a catena α2 di collagene di tipu I (COL1A2), l'α-actina di u musculu lisciu (αSMA), a metalloproteinasi di matrice 2 (MMP2), l'inibitore tissutale di a metalloproteinasi 1 (TIMP1) è u genu simile à a dinamina 1 (DRP1), chì indica una maggiore fibrosi è attivazione. Inoltre, in paragone cù u gruppu di cuntrollu, u trattamentu cù TGF-β1 hà riduttu i livelli di mRNA di u receptore nucleare di pregnane X (PXR), a caspasi 8 (CASP8), MAPKAPK3, l'inibitore di l'α di e cellule B, l'esaltatore di u peptide di luce di u genu di u fattore nucleare κ (NFκB1A) è l'inibitore di a subunità β di a chinasi di u fattore nucleare κB (IKBKB) (Figura 5A-D). In paragone cù u trattamentu TGF-β1, u trattamentu cumminatu cù TGF-β1 è IPA hà riduttu l'espressione di COL1A2 è MMP2, ma hà aumentatu i livelli di mRNA di PXR, TIMP1, linfoma di cellule B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, è IKBKB. U trattamentu IPA hà diminuitu significativamente l'espressione di MMP2, proteina X assuciata à Bcl-2 (BAX), AKT1, proteina di l'atrofia ottica 1 (OPA1), è proteina di fusione mitocondriale 2 (MFN2), mentre chì l'espressione di CASP8, NFκB1A, NFκB1B, è IKBKB hè stata aumentata in paragone cù u gruppu di cuntrollu. Tuttavia, ùn hè stata trovata alcuna differenza in l'espressione di caspasi-3 (CASP3), fattore di attivazione di a peptidasi apoptotica 1 (APAF1), proteina di fusione mitocondriale 1 (MFN1), è proteina di fissione 1 (FIS1). Cullettivamente, sti risultati suggerenu chì u trattamentu IPA modula l'espressione di i geni assuciati à a fibrosi, l'apoptosi, a sopravvivenza è a dinamica mitocondriale. I nostri dati suggerenu chì u trattamentu IPA riduce a fibrosi in e cellule LX-2; à u listessu tempu, stimula a sopravvivenza spostendu u fenotipu versu l'inattivazione.
L'IPA modula l'espressione di i geni di fibroblasti, apoptotici, di viabilità è di dinamica mitocondriale in e cellule LX-2. L'istogrammi mostranu l'espressione di l'mRNA in relazione à u cuntrollu endogenu (RPLP0 o PPIA) dopu chì e cellule LX-2 sò state indotte cù TGF-β1 è IPA in un mezu senza serum per 24 ore. A indica fibroblasti, B indica cellule apoptotiche, C indica cellule sopravviventi è D indica l'espressione genica di dinamica mitocondriale. I dati sò presentati cum'è media ± deviazione standard (SD), n = 3 esperimenti indipendenti. I paraguni statistici sò stati realizati utilizendu ANOVA à una via è test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Dopu, i cambiamenti in a dimensione di e cellule (FSC-H) è a cumplessità citoplasmatica (SSC-H) sò stati valutati per citometria di flussu (Figura 6A, B), è i cambiamenti in a morfologia cellulare dopu u trattamentu IPA sò stati valutati per microscopia elettronica à trasmissione (TEM) è microscopia à cuntrastu di fase (Figura Supplementare 6A-B). Cum'è previstu, e cellule in u gruppu trattatu cù TGF-β1 sò aumentate di dimensione paragunatu à u gruppu di cuntrollu (Figura 6A, B), mustrendu l'espansione classica di u reticulu endoplasmicu ruvidu (ER*) è di i fagolisosomi (P), chì indicanu l'attivazione di e cellule staminali ematopoietiche (HSC) (Figura Supplementare 6A). Tuttavia, paragunatu à u gruppu trattatu cù TGF-β1, a dimensione di e cellule, a cumplessità citoplasmatica (Fig. 6A, B) è u cuntenutu di ER* sò stati diminuiti in u gruppu di trattamentu di cumminazione TGF-β1 è IPA (Figura Supplementare 6A). Inoltre, u trattamentu IPA hà diminuitu a dimensione di e cellule, a cumplessità citoplasmatica (Fig. 6A, B), u cuntenutu di P è ER* (Fig. Supplementare 6A) paragunatu à u gruppu di cuntrollu. Inoltre, u cuntenutu di e cellule apoptotiche hè aumentatu dopu à 24 ore di trattamentu IPA paragunatu à u gruppu di cuntrollu (frecce bianche, Fig. Supplementare 6B). Cullettivamente, sti risultati suggerenu chì 1 mM IPA pò stimulà l'apoptosi HSC è inverte i cambiamenti in i parametri morfologichi cellulari indotti da TGF-β1, regulendu cusì a dimensione è a cumplessità di e cellule, chì ponu esse assuciate à l'inattivazione di HSC.
L'IPA altera a dimensione di e cellule è a cumplessità citoplasmatica in e cellule LX-2. Imagine rappresentative di l'analisi di citometria di flussu. L'analisi hà utilizatu una strategia di gating specifica per e cellule LX-2: SSC-A/FSC-A per definisce a pupulazione cellulare, FSC-H/FSC-A per identificà i dupletti, è SSC-H/FSC-H per l'analisi di a dimensione è di a cumplessità di e cellule. E cellule sò state incubate cù TGF-β1 (5 ng/ml) è 1 mM IPA in un mezu senza serum per 24 ore. E cellule LX-2 sò state distribuite in u quadrantu inferiore sinistro (SSC-H-/FSC-H-), u quadrantu superiore sinistro (SSC-H+/FSC-H-), u quadrantu inferiore destro (SSC-H-/FSC-H+) è u quadrantu superiore destro (SSC-H+/FSC-H+) per l'analisi di a dimensione di e cellule è di a cumplessità citoplasmatica. B. A morfologia cellulare hè stata analizata per citometria di flussu utilizendu FSC-H (scatter frontale, dimensione cellulare) è SSC-H (scatter laterale, cumplessità citoplasmatica) (30.000 eventi). I dati sò presentati cum'è media ± SD, n = 3 esperimenti indipendenti. I paraguni statistici sò stati realizati utilizendu ANOVA à una via è u test post hoc di Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 è ****p < 0,0001
I metaboliti intestinali cum'è l'IPA sò diventati un tema caldu di ricerca, chì suggerisce chì novi bersagli possinu esse scuperti in a microbiota intestinale. Hè dunque interessante chì l'IPA, un metabolitu chì avemu ligatu à a fibrosi epatica in l'omu [15], sia statu dimustratu cum'è un putenziale cumpostu antifibroticu in mudelli animali [13, 14]. Quì, dimustremu per a prima volta una associazione trà l'IPA siericu è a trascrittomica epatica globale è a metilazione di u DNA in individui obesi senza diabete di tipu 2 (T2D), mettendu in risaltu l'apoptosi, a mitofagia è a longevità, è ancu un pussibule genu candidatu AKT1 chì regula l'omeostasi epatica. Un'altra nuvità di u nostru studiu hè chì avemu dimustratu l'interazione di u trattamentu IPA cù l'apoptosi, a morfologia cellulare, a bioenergetica mitocondriale è a dinamica in e cellule LX-2, indicendu un spettru energeticu più bassu chì sposta u fenotipu HSC versu l'inattivazione, rendendu l'IPA un putenziale candidatu per migliurà a fibrosi epatica.
Avemu trovu chì l'apoptosi, a mitofagia è a longevità eranu e vie canoniche più impurtanti arricchite in geni di u fegatu assuciati à l'IPA siericu circulante. L'interruzzione di u sistema di cuntrollu di qualità mitocondriale (MQC) pò purtà à disfunzione mitocondriale, mitofagia è apoptosi, prumove cusì l'occorrenza di MASLD [33, 34]. Dunque, pudemu speculà chì l'IPA puderia esse implicatu in u mantenimentu di a dinamica cellulare è di l'integrità mitocondriale per via di l'apoptosi, a mitofagia è a longevità in u fegatu. I nostri dati anu dimustratu chì dui geni eranu cumuni in i trè saggi: YKT6 è AKT1. Vale a pena nutà chì YKT6 hè una proteina SNARE implicata in u prucessu di fusione di a membrana cellulare. Ghjoca un rolu in l'autofagia è a mitofagia furmendu un cumplessu d'iniziazione cù STX17 è SNAP29 nantu à l'autofagosoma, prumove cusì a fusione di autofagosomi è lisosomi [35]. Inoltre, a perdita di a funzione YKT6 provoca una mitofagia compromessa [36], mentre chì a sovraespressione di YKT6 hè assuciata à a progressione di u carcinoma epatocellulare (HCC), mustrendu una maggiore sopravvivenza cellulare [37]. D’altronde, AKT1 hè u genu interattivu u più impurtante è ghjoca un rolu impurtante in e malatie di u fegatu, cumprese a via di segnalazione PI3K/AKT, u ciclu cellulare, a migrazione cellulare, a proliferazione, l'adesione focale, a funzione mitocondriale è a secrezione di collagene [38-40]. A via di segnalazione PI3K/AKT attivata pò attivà e cellule staminali ematopoietiche (HSC), chì sò e cellule rispunsevuli di a produzzione di matrice extracellulare (ECM), è a so disregulazione pò cuntribuisce à l'occorrenza è a progressione di a fibrosi epatica [40]. Inoltre, AKT hè unu di i fattori chjave di sopravvivenza cellulare chì inibisce l'apoptosi cellulare dipendente da p53, è l'attivazione di AKT pò esse assuciata à l'inibizione di l'apoptosi di e cellule epatiche [41, 42]. I risultati ottenuti suggerenu chì l'IPA pò esse implicatu in l'apoptosi assuciata à i mitocondri epatici influenzendu a decisione di l'epatociti trà entre in apoptosi o sopravvivenza. Questi effetti ponu esse regulati da i geni candidati AKT è/o YKT6, chì sò cruciali per l'omeostasi di u fegatu.
I nostri risultati anu dimustratu chì 1 mM IPA hà induttu l'apoptosi è hà diminuitu a respirazione mitocondriale in e cellule LX-2 indipendentemente da u trattamentu TGF-β1. Hè da nutà chì l'apoptosi hè una via maiò per a risoluzione di a fibrosi è l'attivazione di e cellule staminali ematopoietiche (HSC), è hè ancu un avvenimentu chjave in a risposta fisiologica reversibile di a fibrosi epatica [4, 43]. Inoltre, a restaurazione di BHI in e cellule LX-2 dopu u trattamentu cumminatu hà furnitu novi insights nantu à u rolu putenziale di IPA in a regulazione di a bioenergetica mitocondriale. In cundizioni di riposu è inattive, e cellule ematopoietiche utilizanu nurmalmente a fosforilazione ossidativa mitocondriale per pruduce ATP è anu una bassa attività metabolica. D’altronde, l'attivazione di HSC migliora a respirazione mitocondriale è a biosintesi per cumpensà e richieste energetiche di entrata in u statu glicoliticu [44]. U fattu chì IPA ùn hà micca influenzatu u putenziale metabolicu è ECAR suggerisce chì a via glicolitica hè menu prioritaria. In listessu modu, un altru studiu hà dimustratu chì 1 mM IPA era capace di modulà l'attività di a catena respiratoria mitocondriale in i cardiomiociti, a linea cellulare di l'epatociti umani (Huh7) è e cellule endoteliali di a vena umbilicale umana (HUVEC); Tuttavia, ùn hè statu trovu alcun effettu di l'IPA nantu à a glicolisi in i cardiomiociti, ciò chì suggerisce chì l'IPA pò influenzà a bioenergetica di altri tipi di cellule [45]. Dunque, ipotemu chì 1 mM IPA pò agisce cum'è un disaccoppiatore chimicu lieve, postu chì pò riduce significativamente l'espressione genica fibrogenica, a morfologia cellulare è a bioenergetica mitocondriale senza cambià a quantità di mtDNA [46]. I disaccoppiatori mitocondriali ponu inibisce a fibrosi indotta da a cultura è l'attivazione di HSC [47] è riduce a pruduzzione mitocondriale di ATP regulata o indotta da certe proteine ​​cum'è e proteine ​​disaccoppianti (UCP) o a translocasi di nucleotidi di adenina (ANT). Sicondu u tipu di cellula, questu fenomenu pò prutege e cellule da l'apoptosi è/o prumove l'apoptosi [46]. Tuttavia, ulteriori studii sò necessarii per elucidà u rolu di l'IPA cum'è disaccoppiatore mitocondriale in l'inattivazione di e cellule staminali ematopoietiche.
Avemu dopu investigatu se i cambiamenti in a respirazione mitocondriale sò riflessi in a morfologia mitocondriale in e cellule LX-2 viventi. Hè interessante nutà chì u trattamentu cù TGF-β1 altera a proporzione mitocondriale da sferica à intermedia, cù una diminuzione di a ramificazione mitocondriale è una maggiore espressione di DRP1, un fattore chjave in a fissione mitocondriale [48]. Inoltre, a frammentazione mitocondriale hè assuciata à a cumplessità generale di a rete, è a transizione da a fusione à a fissione hè critica per l'attivazione di e cellule staminali ematopoietiche (HSC), mentre chì l'inibizione di a fissione mitocondriale porta à l'apoptosi di HSC [49]. Cusì, i nostri risultati indicanu chì u trattamentu cù TGF-β1 pò induce una diminuzione di a cumplessità di a rete mitocondriale cù una diminuzione di a ramificazione, chì hè più cumuna in a fissione mitocondriale assuciata à e cellule staminali ematopoietiche attivate (HSC). Inoltre, i nostri dati anu dimustratu chì l'IPA puderia cambià a proporzione di i mitocondri da una forma sferica à una intermedia, riducendu cusì l'espressione di OPA1 è MFN2. Studi anu dimustratu chì a downregulation di OPA1 puderia causà una diminuzione di u putenziale di a membrana mitocondriale è scatenà l'apoptosi cellulare [50]. MFN2 hè cunnisciutu per medià a fusione mitocondriale è l'apoptosi [51]. I risultati ottenuti suggerenu chì l'induzione di e cellule LX-2 da TGF-β1 è/o IPA pare modulà a forma è a dimensione mitocondriale, è ancu u statu d'attivazione è a cumplessità di a rete.
I nostri risultati indicanu chì u trattamentu cumminatu di TGFβ-1 è IPA puderia riduce i parametri morfologichi di u mtDNA è di e cellule regulendu l'espressione di l'mRNA di a fibrosi, l'apoptosi è i geni ligati à a sopravvivenza in e cellule chì evadenu l'apoptosi. Infatti, l'IPA hà diminuitu u livellu di espressione di l'mRNA di AKT1 è di geni impurtanti di fibrosi cum'è COL1A2 è MMP2, ma hà aumentatu u livellu di espressione di CASP8, chì hè assuciatu à l'apoptosi. I nostri risultati anu dimustratu chì dopu u trattamentu IPA, l'espressione di BAX hè diminuita è l'espressione di l'mRNA di e subunità di a famiglia TIMP1, BCL-2 è NF-κB hè aumentata, suggerendu chì l'IPA puderia stimulà i signali di sopravvivenza in e cellule staminali ematopoietiche (HSC) chì evadenu l'apoptosi. Queste molecule ponu agisce cum'è signali pro-sopravvivenza in e cellule staminali ematopoietiche attivate, chì ponu esse assuciati à una maggiore espressione di proteine ​​anti-apoptotiche (cum'è Bcl-2), una diminuzione di l'espressione di BAX pro-apoptoticu è una interazione cumplessa trà TIMP è NF-κB [5, 7]. L'IPA esercita i so effetti per via di PXR, è avemu trovu chì u trattamentu cumminatu cù TGF-β1 è IPA hà aumentatu i livelli d'espressione di mRNA di PXR, indicendu a soppressione di l'attivazione di HSC. A segnalazione PXR attivata hè cunnisciuta per inibisce l'attivazione di HSC sia in vivo sia in vitro [52, 53]. I nostri risultati indicanu chì l'IPA pò participà à l'eliminazione di HSC attivate prumovendu l'apoptosi, riducendu a fibrosi è u metabolismu mitocondriale, è aumentendu i segnali di sopravvivenza, chì sò prucessi tipici chì cunvertenu u fenotipu HSC attivatu in unu inattivatu. Un'altra pussibile spiegazione per u putenziale mecanismu è u rolu di l'IPA in l'apoptosi hè chì elimina i mitocondri disfunzionali principalmente per via di a mitofagia (via intrinseca) è a via di segnalazione estrinseca TNF (Tabella 1), chì hè direttamente ligata à a via di segnalazione di sopravvivenza NF-κB (Figura Supplementare 7). Hè interessante nutà chì i geni arricchiti ligati à l'IPA sò capaci di induce signali pro-apoptotici è pro-sopravvivenza in a via apoptotica [54], ciò chì suggerisce chì l'IPA pò induce a via apoptotica o a sopravvivenza interagendu cù questi geni. Tuttavia, cumu l'IPA induce l'apoptosi o a sopravvivenza durante l'attivazione di HSC è e so vie meccanistiche ùn sò micca chjari.
L'IPA hè un metabolitu microbianu furmatu da u triptofanu dieteticu via a microbiota intestinale. Studi anu dimustratu ch'ellu hà proprietà antiinflamatorie, antioxidanti è epigenetiche regulatorie in l'ambiente intestinale.[55] Studi anu dimustratu chì l'IPA pò modulà a funzione di barriera intestinale è riduce u stress ossidativu, ciò chì pò cuntribuisce à i so effetti fisiologichi lucali.[56] In fatti, l'IPA hè trasportatu à l'organi bersagli via a circulazione, è postu chì l'IPA sparte una struttura metabolica principale simile cù u triptofanu, a serotonina è i derivati ​​indolici, l'IPA esercita azzioni metaboliche chì risultanu in destini metabolichi cumpetitivi.[52] L'IPA pò cumpete cù i metaboliti derivati ​​da u triptofanu per i siti di legame nantu à l'enzimi o i recettori, potenzialmente interrompendu e vie metaboliche nurmali. Questu mette in risaltu a necessità di ulteriori studii nantu à a so farmacocinetica è farmacodinamica per capisce megliu a so finestra terapeutica.[57] Resta da vede se questu pò accade ancu in e cellule staminali ematopoietiche (HSC).
Ricunnoscemu chì u nostru studiu hà qualchì limitazione. Per esaminà specificamente l'associazioni relative à l'IPA, avemu esclusu i pazienti cun diabete mellitus di tipu 2 (T2DM). Ricunnoscemu chì questu limita l'ampia applicabilità di i nostri risultati à i pazienti cun diabete mellitus di tipu 2 è malatie epatiche avanzate. Ancu s'è a cuncentrazione fisiologica di IPA in u serum umanu hè 1-10 μM [11, 20], hè stata scelta una cuncentrazione di 1 mM IPA basata annantu à a più alta cuncentrazione non tossica [15] è u più altu tassu di apoptosi, senza alcuna differenza in a percentuale di a pupulazione di cellule necrotiche. Ancu s'è i livelli suprafisiologichi di IPA sò stati utilizati in questu studiu, ùn ci hè attualmente alcun consensu riguardu à a dosa efficace di IPA [52]. Ancu s'è i nostri risultati sò significativi, u destinu metabolicu più largu di IPA ferma un'area attiva di ricerca. Inoltre, i nostri risultati nantu à l'associazione trà i livelli sierichi di IPA è a metilazione di u DNA di i trascritti epatici sò stati ottenuti micca solu da e cellule staminali ematopoietiche (HSC) ma ancu da i tessuti epatici. Avemu sceltu d'utilizà e cellule LX-2 umane basatu annantu à i nostri risultati precedenti da l'analisi di u trascrittoma chì l'IPA hè assuciatu à l'attivazione di e cellule staminali ematopoietiche (HSC) [15], è l'HSC sò e cellule principali implicate in a progressione di a fibrosi epatica. U fegatu hè cumpostu da parechji tipi di cellule, dunque altri mudelli cellulari cum'è u sistema di cocultura epatocita-HSC-cellule immunitarie cumminatu cù l'attivazione di a caspasi è a frammentazione di u DNA, è ancu u mecanismu d'azione cumpresu u livellu di proteine ​​devenu esse cunsiderati per studià u rolu di l'IPA è a so interazione cù altri tipi di cellule epatiche.