Diverse teorie di difesa di e piante furniscenu una guida teorica impurtante per spiegà i mudelli di metabolismu specializatu di e piante, ma e so predizioni chjave restanu da testà. Quì, avemu utilizatu l'analisi di spettrometria di massa in tandem imparziale (MS/MS) per esplorà sistematicamente u metaboloma di ceppi attenuati da u tabaccu da e piante individuali à e pupulazioni è e spezie strettamente correlate, è avemu trattatu un gran numeru di teorie di caratteristiche spettrometriche di massa basate nantu à spettri cumposti in l'infurmazioni. Quadru per testà e predizioni chjave di e teorie di difesa ottimale (OD) è di bersagliu mobile (MT). A cumpunente d'infurmazione di a metabolomica di e piante hè coerente cù a teoria OD, ma cuntradisce a predizione principale di a teoria MT nantu à a dinamica metabolomica causata da l'erbivori. Da a scala evolutiva micro à a macro, u signale di jasmonatu hè statu identificatu cum'è u determinante principale di OD, mentre chì u signale di etilene hà furnitu una messa a puntu fine di a risposta specifica di l'erbivoru annotata da a rete moleculare MS/MS.
I metaboliti speciali cù strutture diverse sò i principali participanti à l'adattazione di e piante à l'ambiente, in particulare in a difesa di i nemici (1). A sorprendente diversificazione di u metabolismu speciale truvatu in e piante hà stimulatu decennii di ricerca approfondita nantu à i so numerosi aspetti di e funzioni ecologiche, è hà furmatu una longa lista di teorie di difesa di e piante, chì sò u sviluppu evolutivu è ecologicu di l'interazzione pianta-insetti. A ricerca empirica furnisce una guida impurtante (2). Tuttavia, queste teorie di difesa di e piante ùn anu micca seguitu a strada normativa di u ragiunamentu deduttivu ipoteticu, in u quale e previsioni chjave eranu à u listessu livellu d'analisi (3) è sò state testate sperimentalmente per avanzà u prossimu ciclu di sviluppu teoricu (4). E limitazioni tecniche restringenu a raccolta di dati à categurie metaboliche specifiche è escludenu l'analisi cumpleta di metaboliti specializati, impedendu cusì paragoni intercategorie chì sò essenziali per u sviluppu teoricu (5). A mancanza di dati metabolomichi cumpleti è di una valuta cumuna per paragunà u flussu di travagliu di trasfurmazione di u spaziu metabolicu trà diversi gruppi di piante impedisce a maturità scientifica di u campu.
L'ultimi sviluppi in u campu di a metabolomica di a spettrometria di massa in tandem (MS/MS) ponu caratterizà cumpletamente i cambiamenti metabolichi in è trà e spezie di un certu clade di sistema, è ponu esse cumminati cù metudi di calculu per calculà a similitudine strutturale trà queste miscele cumplesse. Cunniscenza previa di chimica (5). A cumminazione di tecnulugie avanzate in analisi è calculu furnisce un quadru necessariu per a prova à longu andà di parechje previsioni fatte da e teorie ecologiche è evolutive di a diversità metabolica. Shannon (6) hà introduttu a teoria di l'infurmazione per a prima volta in u so articulu seminale in u 1948, ponendu e basi per l'analisi matematica di l'infurmazione, chì hè stata aduprata in parechji campi diversi da a so applicazione originale. In genomica, a teoria di l'infurmazione hè stata applicata cù successu per quantificà l'infurmazioni cunservative di sequenza (7). In a ricerca trascrittomica, a teoria di l'infurmazione analizza i cambiamenti generali in u trascrittoma (8). In ricerche precedenti, avemu applicatu u quadru statisticu di a teoria di l'infurmazione à a metabolomica per discrive a cumpetenza metabolica di u livellu tissutale in e piante (9). Quì, cumbinemu u flussu di travagliu basatu annantu à MS/MS cù u quadru statisticu di a teoria di l'infurmazione, carattarizata da a diversità metabolica in a valuta cumuna, per paragunà e predizioni chjave di a teoria di difesa di e piante di u metaboloma induttu da l'erbivori.
I quadri teorichi di a difesa di e piante sò generalmente mutualmente inclusivi è ponu esse divisi in duie categurie: quelli chì cercanu di spiegà a distribuzione di metaboliti specifichi di e piante basati nantu à e funzioni di difesa, cum'è a difesa ottima (OD) (10), u bersagliu mobile (MT) (11)) è a teoria di l'apparizione (12), mentre chì altri cercanu spiegazioni meccaniche di cume i cambiamenti in a dispunibilità di e risorse affettanu a crescita di e piante è l'accumulazione di metaboliti specializati, cum'è u carbone: ipotesi di l'equilibriu nutrizionale (13), ipotesi di u tassu di crescita (14) è l'ipotesi di l'equilibriu di crescita è differenziazione (15). I dui insemi di teorie sò à diversi livelli d'analisi (4). Tuttavia, duie teorie chì implicanu funzioni difensive à u livellu funzionale dominanu a cunversazione nantu à e difese custitutive è inducibili di e piante: a teoria OD, chì assume chì e piante investenu in e so difese chimiche costose solu quandu hè necessariu, per esempiu, quandu sò ingerite Quandu un animale d'erba attacca, dunque, secondu a pussibilità di un attaccu futuru, u compostu cù una funzione difensiva hè assignatu (10); L'ipotesi MT prupone chì ùn ci hè micca un asse di cambiamentu di metaboliti direzionali, ma u metabolitu cambia à casu, creendu cusì a pussibilità d'ostruisce u "bersagliu di muvimentu" metabolicu di l'erbivori attaccanti. In altre parole, ste duie teorie facenu previsioni opposte nantu à u rimodellamentu metabolicu chì si faci dopu à l'attaccu di l'erbivori: a relazione trà l'accumulazione unidirezionale di metaboliti cù funzione difensiva (OD) è i cambiamenti metabolichi micca diretti (MT) (11).
L'ipotesi OD è MT ùn implicanu micca solu i cambiamenti indotti in u metaboloma, ma ancu e cunsequenze ecologiche è evolutive di l'accumulazione di sti metaboliti, cum'è i costi è i benefici adattivi di sti cambiamenti metabolichi in un ambiente ecologicu specificu (16). Ancu s'è e duie ipotesi ricunnoscenu a funzione difensiva di metaboliti specializati, chì ponu esse o micca cari, a predizione chjave chì distingue l'ipotesi OD è MT si trova in a direzionalità di i cambiamenti metabolichi indotti. A predizione di a teoria OD hà ricevutu a più attenzione sperimentale finu à avà. Sti testi includenu u studiu di e funzioni di difesa diretta o indiretta di diversi tessuti di cumposti specifici in serre è cundizioni naturali, è ancu i cambiamenti in u stadiu di sviluppu di e piante (17-19). Tuttavia, finu à avà, per via di a mancanza di un flussu di travagliu è di un quadru statisticu per l'analisi globale cumpleta di a diversità metabolica di qualsiasi urganisimu, a principale differenza di predizione trà e duie teorie (vale à dì, a direzzione di i cambiamenti metabolichi) ferma da testà. Quì, furnimu una tale analisi.
Una di e caratteristiche più significative di i metaboliti specifichi di e piante hè a so estrema diversità strutturale à tutti i livelli, da e piante singole, e pupulazioni à e spezie simili (20). Parechji cambiamenti quantitativi in ​​i metaboliti specializati ponu esse osservati à scala di pupulazione, mentre chì forti differenze qualitative sò generalmente mantenute à livellu di spezia (20). Dunque, a diversità metabolica di e piante hè l'aspettu principale di a diversità funzionale, riflettendu l'adattabilità à diverse nicchie, in particulare quelle nicchie cù diverse pussibilità d'invasione da insetti speciali è erbivori cumuni (21). Dapoi l'articulu innovativu di Fraenkel (22) nantu à e ragioni di l'esistenza di metaboliti specifichi di e piante, l'interazzione cù vari insetti hè stata cunsiderata cum'è pressioni di selezzione impurtanti, è si crede chì queste interazzione anu furmatu e piante durante l'evoluzione. Via metabolica (23). E differenze interspecie in a diversità di i metaboliti specializati ponu ancu riflettà l'equilibriu fisiologicu assuciatu à a difesa custitutiva è inducibile di e piante contr'à e strategie erbivore, postu chì e duie spezie sò spessu correlate negativamente trà di elle (24). Ancu s'ellu pò esse benefiziu di mantene una bona difesa in ogni mumentu, i cambiamenti metabolichi puntuali assuciati à a difesa furniscenu benefici chjari chì permettenu à e piante di assignà risorse preziose à altri investimenti fisiologichi (19, 24), è evitanu a necessità di simbiosi. Danni collaterali (25). Inoltre, queste riurganizzazioni di metaboliti specializati causati da insetti erbivori ponu purtà à una distribuzione distruttiva in a pupulazione (26), è ponu riflette letture dirette di cambiamenti naturali sustanziali in u signale di l'acidu jasmonicu (JA), chì pò esse mantinutu in a pupulazione. I signali JA alti è bassi sò compromessi trà a difesa contr'à l'erbivori è a cumpetizione cù spezie specifiche (27). Inoltre, e vie biosintetiche di metaboliti specializati subiranu una rapida perdita è trasfurmazione durante l'evoluzione, risultendu in una distribuzione metabolica irregulare trà spezie strettamente correlate (28). Questi polimorfismi ponu esse stabiliti rapidamente in risposta à i mudelli erbivori chì cambianu (29), ciò significa chì a fluttuazione di e cumunità erbivore hè un fattore chjave chì guida l'eterogeneità metabolica.
Quì, avemu risoltu specificamente i seguenti prublemi. (I) Cumu l'insettu erbivoru riconfigura u metaboloma di a pianta ? (Ii) Quali sò i principali cumpunenti d'infurmazione di a plasticità metabolica chì ponu esse quantificati per testà e previsioni di a teoria di a difesa à longu andà ? (Iii) S'ellu si deve riprogramà u metaboloma di a pianta in un modu unicu per l'attaccante, s'ellu hè cusì, chì rolu ghjoca l'ormone vegetale in l'adattamentu di una risposta metabolica specifica, è quali metaboliti cuntribuiscenu à a specificità di spezie di a difesa ? (Iv) Siccomu e previsioni fatte da parechje teorie di difesa ponu esse estese à tutti i livelli di tessuti biologichi, ci simu dumandati quantu hè coerente a risposta metabolica causata da u paragone internu à u paragone interspecie ? À questu scopu, avemu studiatu sistematicamente u metaboloma fogliare di a nicotina di u tabaccu, chì hè una pianta mudellu ecologica cù un metabolismu riccu specializatu, è hè efficace contr'à e larve di dui erbivori nativi, Lepidoptera Datura (Ms) (assai aggressivu, principalmente manghjatu). Nantu à e Solanaceae è Spodoptera littoralis (Sl), i vermi di e foglie di cuttuni sò una spezia di "genere", cù e piante ospiti di Solanaceae è altri ospiti di altri generi è famiglie Plant food. Avemu analizatu u spettru metabolomicu MS/MS è estrattu i descrittori statistici di a teoria di l'infurmazione per paragunà e teorie OD è MT. Creà carte di specificità per revelà l'identità di i metaboliti chjave. L'analisi hè stata allargata à a pupulazione nativa di N. nasi è spezie di tabaccu strettamente correlate per analizà ulteriormente a covarianza trà a segnalazione di l'ormoni vegetali è l'induzione OD.
Per catturà una mappa generale di a plasticità è di a struttura di u metaboloma fogliare di u tabaccu erbivoru, avemu utilizatu un flussu di travagliu d'analisi è di calculu sviluppatu in precedenza per raccoglie è deconvolutà in modu cumpletu spettri MS/MS indipendenti da dati d'alta risoluzione da estratti di piante (9). Stu metudu indifferenziatu (chjamatu MS/MS) pò custruisce spettri di cumposti non ridondanti, chì ponu esse poi utilizati per tutte l'analisi à livellu di cumposti descritte quì. Quessi metaboliti vegetali deconvoluti sò di vari tipi, custituiti da centinaie à migliaia di metaboliti (circa 500-1000-s/MS/MS quì). Quì, cunsideremu a plasticità metabolica in u quadru di a teoria di l'infurmazione, è quantificemu a diversità è u prufessionalisimu di u metaboloma basatu annantu à l'entropia di Shannon di a distribuzione di frequenza metabolica. Usendu a formula implementata in precedenza (8), avemu calculatu un inseme d'indicatori chì ponu esse utilizati per quantificà a diversità di u metaboloma (indicatore Hj), a specializazione di u prufilu metabolicu (indicatore δj) è a specificità metabolica di un unicu metabolitu (indicatore Si). Inoltre, avemu applicatu l'Indice di Plasticità di Distanza Relativa (RDPI) per quantificà l'inducibilità di u metaboloma di l'erbivori (Figura 1A) (30). In questu quadru statisticu, trattemu u spettru MS/MS cum'è l'unità d'infurmazione basica, è processemu l'abbundanza relativa di MS/MS in una mappa di distribuzione di frequenza, è dopu usemu l'entropia di Shannon per stimà a diversità di u metaboloma da questu. A specializazione di u metaboloma hè misurata da a specificità media di un unicu spettru MS/MS. Dunque, l'aumentu di l'abbundanza di alcune classi MS/MS dopu l'induzione di l'erbivori hè trasfurmatu in inducibilità spettrale, RDPI è specializazione, vale à dì, l'aumentu di l'indice δj, perchè si producenu metaboliti più specializati è si produce un indice Si altu. L'abbassamentu di l'indice di diversità Hj riflette chì o u numeru di MS/MS generati hè riduttu, o a distribuzione di frequenza di u prufilu cambia in una direzzione menu uniforme, riducendu à tempu a so incertezza generale. Attraversu u calculu di l'indice Si, hè pussibule di mette in risaltu quali MS/MS sò indotti da certi erbivori, à u cuntrariu, quali MS/MS ùn rispondenu micca à l'induzione, ciò chì hè un indicatore chjave per distingue a predizione MT è OD.
(A) Descrittori statistici utilizati per l'inducibilità di dati MS/MS erbivori (H1 à Hx) (RDPI), a diversità (indice Hj), a specializazione (indice δj) è a specificità di i metaboliti (indice Si). Un aumentu di u gradu di specializazione (δj) indica chì, in media, saranu prudutti più metaboliti specifichi erbivori, mentre chì una diminuzione di a diversità (Hj) indica una diminuzione di a produzzione di metaboliti o una distribuzione irregulare di metaboliti in a mappa di distribuzione. U valore Si valuta se u metabolitu hè specificu per una data cundizione (quì, erbivoru) o viceversa mantinutu à u listessu livellu. (B) Diagramma cuncettuale di a predizione di a teoria di a difesa utilizendu l'asse di a teoria di l'infurmazione. A teoria OD prevede chì l'attaccu di l'erbivori aumenterà i metaboliti di difesa, aumentendu cusì δj. À u listessu tempu, Hj diminuisce perchè u prufilu hè riurganizatu versu a ridutta incertezza di l'infurmazione metabolica. A teoria MT prevede chì l'attaccu di l'erbivori causerà cambiamenti non direzionali in u metaboloma, aumentendu cusì Hj cum'è indicatore di una maggiore incertezza di l'infurmazione metabolica è causendu una distribuzione casuale di Si. Avemu ancu prupostu un mudellu mistu, u megliu MT, in u quale certi metaboliti cù valori difensivi più alti saranu particularmente aumentati (valore di Si altu), mentre chì altri mostranu risposte aleatorie (valore di Si più bassu).
Utilizendu i descrittori di a teoria di l'infurmazione, interpretemu a teoria OD per prevede chì i cambiamenti di metaboliti speciali indotti da erbivori in un statu custitutivu non induttu porteranu à (i) un aumentu di a specificità metabolica (indice Si) chì porta à a specificità metabonomica (indice δj). L'aumentu di) certi gruppi di metaboliti speciali cù un valore di difesa più altu, è (ii) a diminuzione di a diversità di u metaboloma (indice Hj) per via di u cambiamentu di a distribuzione di a frequenza metabolica à una distribuzione di u corpu più elevata di leptina. À u livellu di un unicu metabolitu, si prevede una distribuzione ordinata di Si, induve u metabolitu aumenterà u valore di Si secondu u so valore di difesa (Figura 1B). In questu sensu, spieghemu a teoria MT per prevede chì l'eccitazione porterà à (i) cambiamenti non direzionali in i metaboliti chì risultanu in una diminuzione di l'indice δj, è (ii) un aumentu di l'indice Hj per via di un aumentu di l'incertezza metabolica. O aleatorietà, chì pò esse quantificata da l'entropia di Shannon in forma di diversità generalizzata. In quantu à a cumpusizione metabolica, a teoria MT predirà a distribuzione casuale di Si. Tenendu contu chì certi metaboliti sò sottu à cundizioni specifiche sottu à cundizioni specifiche, è altre cundizioni ùn sò micca sottu à cundizioni specifiche, è u so valore di difesa dipende da l'ambiente, avemu ancu prupostu un mudellu di difesa mista, in u quale δj è Hj sò distribuiti in dui longu à Si. Aumenta in tutte e direzzione, solu certi gruppi di metaboliti, chì anu valori di difesa più alti, aumenteranu particularmente Si, mentre chì altri averanu una distribuzione aleatoria (Figura 1B).
Per pruvà a predizione di a teoria di a difesa ridefinita nantu à l'asse di u descrittore di a teoria di l'infurmazione, avemu suscitatu larve erbivore esperte (Ms) o generaliste (Sl) nantu à e foglie di Nepenthes pallens (Figura 2A). Usendu l'analisi MS/MS, avemu recuperatu 599 spettri MS/MS non ridondanti (file di dati S1) da estratti di metanolu di tissutu fogliare raccoltu dopu l'alimentazione di i bruchi. L'usu di l'indici RDPI, Hj è δj per visualizà a riconfigurazione di u cuntenutu di l'infurmazione in i file di cunfigurazione MS/MS rivela schemi interessanti (Figura 2B). A tendenza generale hè chì, cum'è descrittu da u descrittore di l'infurmazione, mentre i bruchi cuntinueghjanu à manghjà e foglie, u gradu di tutta a riurganizazione metabolica aumenta cù u tempu: 72 ore dopu chì l'erbivoru hà manghjatu, l'RDPI aumenta significativamente. Paragunatu à u cuntrollu senza danni, Hj hè statu significativamente riduttu, ciò chì era duvutu à l'aumentu di u gradu di specializazione di u prufilu metabolicu, chì hè statu quantificatu da l'indice δj. Questa tendenza apparente hè coerente cù e predizioni di a teoria OD, ma hè incoerente cù e predizioni principali di a teoria MT, chì crede chì i cambiamenti aleatorii (non direzionali) in i livelli di metaboliti sò aduprati cum'è un camouflage difensivu (Figura 1B). Ancu s'è u cuntenutu di l'elicitore di a secrezione orale (OS) è u cumpurtamentu alimentariu di sti dui erbivori sò diffirenti, a so alimentazione diretta hà risultatu in cambiamenti simili in e direzioni di Hj è δj durante i periodi di racolta di 24 ore è 72 ore. L'unica differenza hè accaduta à 72 ore di RDPI. In paragone cù quellu causatu da l'alimentazione Ms, u metabolismu generale induttu da l'alimentazione Sl era più altu.
(A) Disegnu sperimentale: i porchi cumuni (S1) o erbivori esperti (Ms) sò alimentati cù foglie desalinizate di piante carnivore, mentre chì per l'erbivorìa simulata, l'OS di Ms (W + OSMs) hè adupratu per trattà a puntura di e pusizioni standardizate di e foglie. Larve S1 (W + OSSl) o acqua (W + W). U cuntrollu (C) hè una foglia sana. (B) Inducibilità (RDPI paragunatu cù u graficu di cuntrollu), diversità (indice Hj) è indice di specializazione (indice δj) calculati per a mappa speciale di metaboliti (599 MS/MS; schedariu di dati S1). L'asterischi indicanu differenze significative trà l'alimentazione diretta da erbivori è u gruppu di cuntrollu (test t di Student cù test t appaiatu, *P<0,05 è ***P<0,001). ns, micca impurtante. (C) Indice di risoluzione temporale di u spettru principale (scatula blu, aminoacidu, acidu organicu è zuccheru; schedariu di dati S2) è di u spettru di i metaboliti speciali (scatula rossa 443 MS/MS; schedariu di dati S1) dopu à u trattamentu erbivoru simulatu. A banda di culore si riferisce à l'intervallu di cunfidenza di 95%. L'asteriscu indica a differenza significativa trà u trattamentu è u cuntrollu [analisi quadratica di a varianza (ANOVA), seguita da a differenza onestamente significativa di Tukey (HSD) per paragoni multipli post hoc, *P<0,05, **P<0,01 è *** P<0,001]. (D) Specializazione di i grafici di dispersione è di i profili di metaboliti speciali (campioni ripetuti cù trattamenti diversi).
Per esplorà se u rimodellamentu induttu da l'erbivori à u livellu di u metaboloma hè riflessu in i cambiamenti in u livellu di i metaboliti individuali, ci simu prima cuncentrati nantu à i metaboliti studiati prima in e foglie di Nepenthes pallens cù resistenza pruvata à l'erbivori. L'ammidi fenoliche sò coniugati di idrossicinnamamide-poliammina chì s'accumulanu durante u prucessu di erbivori di l'insetti è sò cunnisciuti per riduce e prestazioni di l'insetti (32). Avemu cercatu i precursori di u MS/MS currispundente è tracciatu e so curve cinetiche cumulative (Figura S1). Senza surpresa, i derivati ​​​​di fenolu chì ùn sò micca direttamente implicati in a difesa contr'à l'erbivori, cum'è l'acidu clorogenicu (CGA) è a rutina, sò sotturegulati dopu l'erbivori. In cuntrastu, l'erbivori ponu rende l'ammidi di fenolu assai potenti. L'alimentazione cuntinua di i dui erbivori hà risultatu in quasi u listessu spettru di eccitazione di fenolamidi, è questu mudellu era particularmente evidente per a sintesi de novo di fenolamidi. U listessu fenomenu serà osservatu quandu si esplora a via di i glicosidi diterpenici 17-idrossigeranil nonanedioli (17-HGL-DTG), chì produce un gran numeru di diterpeni aciclici cù funzioni anti-erbivore efficaci (33), di i quali l'alimentazione di Ms cù Sl hà scatenatu un prufilu d'espressione simile (Figura S1)).
U pussibule svantaghju di l'esperimenti di alimentazione diretta da erbivori hè a differenza in u tassu di cunsumu di foglie è u tempu di alimentazione di l'erbivori, ciò chì rende difficiule eliminà l'effetti specifichi di l'erbivori causati da ferite è erbivori. Per risolve megliu a specificità di e spezie erbivore di a risposta metabolica di e foglie indotta, avemu simulatu l'alimentazione di e larve Ms è Sl applicendu immediatamente l'OS appena raccoltu (OSM è OSS1) à a puntura standard W di pusizioni di foglie consistenti. Questa prucedura hè chjamata trattamentu W + OS, è standardizeghja l'induzione timingendu precisamente l'iniziu di a risposta suscitata da l'erbivoru senza causà effetti cunfusi di differenze in u tassu o a quantità di perdita di tessuti (Figura 2A) (34). Usendu a pipeline di analisi è calculu MS/MS, avemu recuperatu 443 spettri MS/MS (file di dati S1), chì si sovrapponevanu cù i spettri precedentemente assemblati da esperimenti di alimentazione diretta. L'analisi di a teoria di l'infurmazione di questu inseme di dati MS/MS hà dimustratu chì a riprogrammazione di metabolomi specializati in foglie simulendu erbivori hà dimustratu induczioni specifiche di OS (Figura 2C). In particulare, paragunatu à u trattamentu OSS1, OSM hà causatu un aumentu di a specializazione di u metaboloma à 4 ore. Vale a pena nutà chì, paragunatu à u set di dati sperimentali di alimentazione diretta di l'erbivori, a cinetica metabolica visualizata in u spaziu bidimensionale aduprendu Hj è δj cum'è coordinate è a direzionalità di a specializazione di u metaboloma in risposta à u trattamentu simulatu di l'erbivori in u tempu hè aumentata in modu consistente (Figura 2D). À u listessu tempu, avemu quantificatu u cuntenutu di aminoacidi, acidi organici è zuccheri (file di dati S2) per investigà se questu aumentu miratu di a cumpetenza di u metaboloma hè duvutu à a riconfigurazione di u metabolismu cintrale di u carbone in risposta à l'erbivori simulati (Figura S2). Per spiegà megliu questu mudellu, avemu monitoratu ulteriormente a cinetica di accumulazione metabolica di e vie di fenolamide è 17-HGL-DTG discusse prima. L'induzione specifica di OS di l'erbivori hè trasformata in un mudellu di riarrangiamentu differenziale in u metabolismu di a fenolamide (Figura S3). L'ammidi fenoliche chì cuntenenu cumarina è gruppi caffeoilici sò preferenzialmente indotti da OSS1, mentre chì l'OSM scatenanu una induzione specifica di coniugati di ferulile. Per a via 17-HGL-DTG, hè stata rilevata una induzione differenziale di OS per via di prudutti di malonilazione è di dimalonilazione à valle (Figura S3).
Dopu, avemu studiatu a plasticità di u trascrittoma indotta da OS utilizendu u set di dati di microarray di corsu di tempu, chì simula l'usu di OSM per trattà e foglie di e foglie di e piante di rosetta in erbivori. A cinetica di campionamentu si sovrappone basicamente à a cinetica utilizata in questu studiu metabolomicu (35). In paragone cù a ricunfigurazione di u metaboloma in a quale a plasticità metabolica hè particularmente aumentata cù u tempu, observemu scoppi di trascrizione transitori in e foglie indotte da Ms, induve l'induttibilità di u trascrittoma (RDPI) è a specializazione (δj) sò à 1. Ci hè statu un aumentu significativu di l'ore, è di a diversità (Hj) à questu puntu di tempu, l'espressione di BMP1 hè stata significativamente ridutta, seguita da u rilassamentu di a specializazione di u trascrittoma (Figura S4). E famiglie di geni metabolichi (cum'è P450, glicosiltransferasi è BAHD aciltransferasi) participanu à u prucessu di assemblaggio di metaboliti speciali da unità strutturali derivate da u metabolismu primariu, seguendu u mudellu di alta specializazione iniziale sopra menzionatu. Cum'è studiu di casu, hè stata analizata a via di a fenilalanina. L'analisi hà cunfirmatu chì i geni principali in u metabolismu di a fenolamide sò assai indotti da OS in l'erbivori paragunatu à e piante micca attratte, è sò strettamente allineati in i so mudelli d'espressione. U fattore di trascrizione MYB8 è i geni strutturali PAL1, PAL2, C4H è 4CL à monte di sta via anu mostratu un iniziu precoce di a trascrizione. L'aciltransferasi chì ghjocanu un rolu in l'assemblea finale di a fenolamide, cum'è AT1, DH29 è CV86, mostranu un mudellu di sovraespressione prolungatu (Figura S4). L'osservazioni sopra indicanu chì l'iniziu precoce di a specializazione di u trascrittoma è u rinfurzamentu successivu di a specializazione metabolomica sò una modalità accoppiata, chì pò esse duvuta à u sistema regulatoriu sincronu chì inizia una putente risposta di difesa.
A ricunfigurazione in a segnalazione di l'ormoni vegetali agisce cum'è un stratu regulatoriu chì integra l'infurmazioni erbivore per riprogramà a fisiologia di e piante. Dopu a simulazione di l'erbivori, avemu misuratu a dinamica cumulativa di e categurie chjave di l'ormoni vegetali è visualizatu a coespressione temporale trà elle [coefficiente di currelazione di Pearson (PCC)> 0.4] (Figura 3A). Cum'è previstu, l'ormoni vegetali ligati à a biosintesi sò ligati in a rete di coespressione di l'ormoni vegetali. Inoltre, a specificità metabolica (indice Si) hè mappata à sta rete per mette in risaltu l'ormoni vegetali indotti da diversi trattamenti. Sò tracciate duie zone principali di risposta specifica erbivora: una hè in u cluster JA, induve JA (a so forma biologicamente attiva JA-Ile) è altri derivati ​​JA mostranu u puntu Si più altu; l'altra hè l'etilene (ET). A gibberellina hà mostratu solu un aumentu moderatu di a specificità erbivora, mentre chì altri ormoni vegetali, cum'è a citochinina, l'auxina è l'acidu abscissicu, avianu una bassa specificità d'induzione per l'erbivori. In paragone cù l'usu di W + W solu, l'amplificazione di u valore di piccu di i derivati ​​JA per via di l'applicazione OS (W + OS) pò esse basicamente trasfurmata in un forte indicatore specificu di JA. Inaspettatamente, OSM è OSS1 cù un cuntenutu di elicitore differente sò cunnisciuti per causà una accumulazione simile di JA è JA-Ile. In cuntrastu cù OSS1, OSM hè specificamente è fortemente induttu da OSM, mentre chì OSS1 ùn amplifica micca a risposta di e ferite basali (Figura 3B).
(A) Analisi di a rete di co-espressione basata annantu à u calculu PCC di a simulazione di a cinetica di l'accumulazione di l'ormoni vegetali indotti da l'erbivori. U nodu rapprisenta un unicu ormone vegetale, è a dimensione di u nodu rapprisenta l'indice Si specificu per l'ormone vegetale trà i trattamenti. (B) Accumulazione di JA, JA-Ile è ET in e foglie causata da diversi trattamenti indicati da diversi culori: albicocca, W + OSM; blu, W + OSSl; neru, W + W; grisgiu, C (cuntrollu). L'asterischi indicanu differenze significative trà u trattamentu è u cuntrollu (ANOVA à duie vie seguita da paragone multiplu post hoc di Tukey HSD, *** P <0,001). Analisi di a teoria di l'infurmazione di (C)697 MS/MS (file di dati S1) in a biosintesi di JA è u spettru di percezione alteratu (irAOC è irCOI1) è (D)585 MS/MS (file di dati S1) in ETR1 cù signale ET alteratu. Dui trattamenti erbivori simulati anu attivatu linee di piante è piante di cuntrollu di veiculi vioti (EV). L'asterischi indicanu differenze significative trà u trattamentu W+OS è u cuntrollu senza danni (ANOVA à duie vie seguita da paragone multiplu post hoc di Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 è ***P<0,001). (E) Grafici spargugliati di l'uppusizione spargugliata à a specializazione. I culori rapprisentanu diverse ceppe geneticamente mudificate; i simbuli rapprisentanu diversi metudi di trattamentu: triangulu, W + OSS1; rettangulu, W + OSM; cerchju C
Dopu, usemu una ceppa geneticamente mudificata di Nepenthes attenuata (irCOI1 è sETR1) in i passi chjave di a biosintesi di JA è ET (irAOC è irACO) è a percezione (irCOI1 è sETR1) per analizà u metabolismu di sti dui ormoni vegetali nantu à l'erbivori. U cuntributu relativu di a riprogrammazione. In cunfurmità cù l'esperimenti precedenti, avemu cunfirmatu l'induzione di l'erbivoru-OS in e piante purtatrici viote (EV) (Figura 3, da C à D) è a diminuzione generale di l'indice Hj causata da OSM, mentre chì l'indice δj hè aumentatu. A risposta hè più pronunciata di a risposta scatenata da OSS1. Un graficu à duie linee chì usa Hj è δj cum'è coordinate mostra a deregulation specifica (Figura 3E). A tendenza più evidente hè chì in e ceppe chì mancanu di signale JA, a diversità di u metaboloma è i cambiamenti di specializazione causati da l'erbivori sò quasi cumpletamente eliminati (Figura 3C). In cuntrastu, a percezione silenziosa di ET in e piante sETR1, ancu s'è l'effettu generale nantu à i cambiamenti in u metabolismu erbivoru hè assai più bassu di quellu di a segnalazione JA, attenua a differenza in l'indici Hj è δj trà l'eccitazioni OSM è OSS1 (Figura 3D è Figura S5). Questu indica chì, in più di a funzione principale di a trasduzione di u signale JA, a trasduzione di u signale ET serve ancu cum'è una regolazione fine di a risposta metabolica specifica di a spezia di l'erbivori. In cunfurmità cù sta funzione di regolazione fine, ùn ci hè statu alcun cambiamentu in l'inducibilità generale di u metaboloma in e piante sETR1. D’altronde, paragunatu à e piante sETR1, e piante irACO anu induttu ampiezze generali simili di cambiamenti metabolichi causati da l'erbivori, ma anu mostratu punteggi Hj è δj significativamente diversi trà e sfide OSM è OSS1 (Figura S5).
Per identificà i metaboliti spezializati chì anu cuntribuzioni impurtanti à a risposta specifica di e spezie di l'erbivori è affinà a so pruduzzione per mezu di signali ET, avemu utilizatu u metudu MS/MS strutturale sviluppatu prima. Stu metudu si basa nantu à u metudu di bi-clustering per reinferisce a famiglia metabolica da frammenti MS/MS [produttu puntuale nurmalizatu (NDP)] è u puntu di similarità basatu annantu à a perdita neutra (NL). U set di dati MS/MS custruitu per mezu di l'analisi di linee transgeniche ET hà pruduttu 585 MS/MS (file di dati S1), chì hè statu risoltu raggruppenduli in sette moduli MS/MS principali (M) (Figura 4A). Alcuni di sti moduli sò densamente imballati cù metaboliti spezializati prima carattarizati: per esempiu, M1, M2, M3, M4 è M7 sò ricchi di vari derivati ​​fenolici (M1), glicosidi flavonoidi (M2), zuccheri acil (M3 è M4) è 17-HGL-DTG (M7). Inoltre, l'infurmazioni specifiche metaboliche (indice Si) di un unicu metabolitu in ogni modulu sò calculate, è a so distribuzione di Si pò esse vista intuitivamente. In breve, i spettri MS/MS chì mostranu una alta specificità di erbivori è genotipu sò carattarizati da alti valori di Si, è e statistiche di kurtosi indicanu a distribuzione di a pelliccia nantu à l'angulu drittu di a coda. Una tale distribuzione colloidale magra hè stata rilevata in M1, in a quale a fenolammide hà mostratu a più alta frazione di Si (Figura 4B). U 17-HGL-DTG inducibile erbivoru citatu prima in M7 hà mostratu un puntuatu Si moderatu, chì indica un gradu moderatu di regulazione differenziale trà i dui tipi di OS. In cuntrastu, a maiò parte di i metaboliti specializati prudutti custitutivamente, cum'è a rutina, u CGA è i zuccheri acilichi, sò trà i punteggi Si più bassi. Per esplorà megliu a cumplessità strutturale è a distribuzione di Si trà metaboliti speciali, hè stata custruita una rete moleculare per ogni modulu (Figura 4B). Una predizione impurtante di a teoria OD (riassunta in a Figura 1B) hè chì a riurganizazione di metaboliti speciali dopu l'erbivori duveria purtà à cambiamenti unidirezionali in i metaboliti cù un altu valore di difesa, in particulare aumentendu a so specificità (in uppusizione à a distribuzione casuale) Modu) Metabolitu difensivu previstu da a teoria MT. A maiò parte di i derivati ​​​​di fenolu accumulati in M1 sò funziunalmente ligati à u declinu di e prestazioni di l'insetti (32). Quandu si paragunanu i valori di Si in i metaboliti M1 trà e foglie indotte è e foglie custituenti di e piante di cuntrollu EV à 24 ore, avemu osservatu chì a specificità metabolica di parechji metaboliti dopu l'insetti erbivori hà una tendenza crescente significativa (Figura 4C). L'aumentu specificu di u valore Si hè statu rilevatu solu in fenolamidi difensivi, ma nisun aumentu di u valore Si hè statu rilevatu in altri fenoli è metaboliti scunnisciuti chì coesistenu in questu modulu. Questu hè un mudellu specializatu, chì hè ligatu à a teoria OD. E principali predizioni di cambiamenti metabolichi causati da erbivori sò coerenti. Per verificà s'ellu sta particularità di u spettru di a fenolamide era indutta da ET specificu di OS, avemu tracciatu l'indice Si di u metabolitu è ​​causatu un valore d'espressione differenziale trà OSM è OSS1 in i genotipi EV è sETR1 (Figura 4D). In sETR1, a differenza indotta da a fenamide trà OSM è OSS1 hè stata assai ridutta. U metudu di bi-clustering hè statu ancu applicatu à i dati MS/MS raccolti in ceppi cù JA insufficiente per deduce i principali moduli MS/MS ligati à a specializazione metabolica regulata da JA (Figura S6).
(A) I risultati di clustering di 585 MS/MS basati annantu à u frammentu spartutu (similarità NDP) è a perdita neutra spartuta (similarità NL) risultanu in u modulu (M) chì hè coerente cù a famiglia di cumposti cunnisciuta, o per una cumpusizione di metaboliti scunnisciuta o pocu metabolizata. Accantu à ogni modulu, hè mostrata a distribuzione specifica di u metabolitu (MS/MS) (Si). (B) Rete moleculare modulare: I nodi rapprisentanu MS/MS è i bordi, i punteggi MS/MS NDP (rossu) è NL (blu) (cut-off, > 0,6). L'indice di specificità di u metabolitu graduatu (Si) culuritu secondu u modulu (à manca) è mappatu à a rete moleculare (à diritta). (C) Modulu M1 di a pianta EV in statu custitutivu (cuntrollu) è induttu (erbivoru simulatu) à 24 ore: diagramma di a rete moleculare (u valore Si hè a dimensione di u nodu, a fenolamide difensiva hè evidenziata in blu). (D) U diagrama di a rete moleculare M1 di a linea di spettru sETR1 cù percezione EV è ET alterata: u cumpostu fenolicu rapprisintatu da u nodu di u cerchju verde, è a differenza significativa (valore P) trà i trattamenti W + OSM è W + OSS1 cum'è dimensione di u nodu. CP, N-caffeoil-tirosina; CS, N-caffeoil-spermidina; FP, acidu N-ferulicu estere-uricu; FS, N-ferulil-spermidina; CoP, N', N “-Coumarolil-tirosina; DCS, N', N”-dicaffeoil-spermidina; CFS, N', N”-caffeoil, feruloil-spermidina; Lycium barbarum in wolfberry Son; Nick. O-AS, zuccheru O-acil.
Avemu allargatu ulteriormente l'analisi da un unicu genotipu attenuatu di Nepenthes à e pupulazioni naturali, induve forti cambiamenti intraspecifici in i livelli di JA erbivori è i livelli di metaboliti specifici sò stati descritti prima in pupulazioni naturali (26). Aduprate questu inseme di dati per copre 43 germoplasmi. Quessi germoplasmi sò custituiti da 123 spezie di piante di N. pallens. Queste piante sò state prelevate da semi raccolti in diversi habitat nativi in ​​Utah, Nevada, Arizona è California (Figura S7), avemu calculatu a diversità di u metaboloma (quì chjamata livellu di pupulazione) β diversità) è a specializazione causata da OSM. In cunfurmità cù studii precedenti, avemu osservatu una vasta gamma di cambiamenti metabolichi longu l'assi Hj è δj, chì indicanu chì i germoplasmi anu differenze significative in a plasticità di e so risposte metaboliche à l'erbivori (Figura S7). Questa urganizazione ricorda l'osservazioni precedenti nantu à a gamma dinamica di i cambiamenti di JA causati da l'erbivori, è hà mantinutu un valore assai altu in una sola pupulazione (26, 36). Utilizendu JA è JA-Ile per pruvà a currelazione generale di u livellu trà Hj è δj, avemu trovu chì ci hè una currelazione pusitiva significativa trà JA è l'indice di diversità è specializazione di u metaboloma β (Figura S7). Questu suggerisce chì l'eterogeneità indotta da l'erbivori in l'induzione di JA rilevata à u livellu di a pupulazione pò esse dovuta à polimorfismi metabolichi chjave causati da a selezzione da l'insetti erbivori.
Studi precedenti anu dimustratu chì i tipi di tabaccu differiscenu assai in u tipu è a dipendenza relativa da e difese metaboliche indotte è custitutive. Si crede chì questi cambiamenti in a trasduzione di u signale anti-erbivoru è e capacità di difesa sò regulati da a pressione di a pupulazione di l'insetti, u ciclu di vita di a pianta è i costi di pruduzzione di difesa in a nicchia induve cresce una data spezia. Avemu studiatu a consistenza di u rimodellamentu di u metaboloma fogliare induttu da erbivori di sei spezie di Nicotiana native di l'America di u Nordu è di l'America di u Sud. Queste spezie sò strettamente imparentate cù Nepenthes America di u Nordu, vale à dì Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. erba attenuata, Nicotiana tabacum, tabaccu lineare, tabaccu (Nicotiana spegazzinii) è tabaccu di foglia di tabaccu (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Sei di queste spezie, cumprese a spezia ben caratterizzata N. please, sò piante annuali di u clade petunia, è obtusifolia N. sò piante perenni di u clade surella Trigonophyllae (38). In seguitu, l'induzione W + W, W + OSM è W + OSS1 hè stata realizata nantu à queste sette spezie per studià u riarrangiamentu metabolicu di l'alimentazione di l'insetti à livellu di spezie.
(A) Un arburu filogeneticu bootstrap basatu annantu à a massima probabilità [per a sintesi di glutammina nucleare (38)] è a distribuzione geografica di sette spezie di Nicotiana strettamente correlate (culori diversi) (37). (B) Un graficu di dispersione di a diversità specializata per i profili metabolichi di sette spezie di Nicotiana (939 MS/MS; schedariu di dati S1). À u livellu di e spezie, a diversità di u metaboloma hè correlata negativamente cù u gradu di specializazione. L'analisi di a currelazione à livellu di spezie trà a diversità metabolica è a specializazione è l'accumulazione di JA hè mostrata in a Figura 2. S9. Culore, diversi tipi; triangulu, W + OSS1; rettangulu, W + OSM; (C) E dinamiche di JA è JA-Ile di Nicotiana sò classificate secondu l'ampiezza di eccitazione OS (ANOVA à duie vie è paragone post-multiplu di Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 è * ** Per u paragone di W + OS è W + W, P <0,001). Graficu a scatula di (D) diversità è (E) specializazione di ogni spezie dopu a simulazione di JA erbivoru è metilu (MeJA). L'asteriscu indica a differenza significativa trà W + OS è W + W o lanolina più W (Lan + W) o Lan più MeJA (Lan + MeJa) è u cuntrollu Lan (analisi di varianza à duie vie, seguita da paragone multiplu post hoc HSD di Tukey, * P < 0,05, ** P < 0,01 è *** P < 0,001).
Utilizendu u metudu di u doppiu cluster, avemu identificatu 9 moduli di 939 MS/MS (schedariu di dati S1). A cumpusizione di MS/MS riconfigurata da diversi trattamenti varia assai trà i diversi moduli trà e spezie (Figura S8). A visualizazione di Hj (chjamata quì γ-diversità à livellu di spezie) è δj rivela chì diverse spezie si aggreganu in gruppi assai diversi in u spaziu metabolicu, induve a divisione à livellu di spezie hè di solitu più prominente chè l'eccitazione. Cù l'eccezzione di N. linear è N. obliquus, mostranu una vasta gamma dinamica di effetti d'induzione (Figura 5B). In cuntrastu, spezie cum'è N. purpurea è N. obtusifolia anu una risposta metabolica menu evidente à u trattamentu, ma u metaboloma hè più diversu. A distribuzione specifica di a risposta metabolica indotta hà risultatu in una currelazione negativa significativa trà a specializazione è a diversità gamma (PCC = -0,46, P = 4,9 × 10-8). I cambiamenti indotti da OS in i livelli di JA sò pusitivamente correlati cù a specializazione di u metaboloma, è negativamente correlati cù a diversità gamma metabolica mostrata da ogni spezie (Figura 5B è Figura S9). Hè da nutà chì e spezie chjamate colloquialmente spezie di "risposta à u signale" in a Figura 5C, cum'è Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute, è Nepenthes attenuated, anu causatu segni significativi à 30 minuti. I recenti focolai di JA è JA-Ile specifichi di OS, mentre chì altri batteri chjamati "senza risposta à u signale", cum'è Nepenthes mills, Nepenthes powdery è N. obtusifolia mostranu solu induzione di JA-Ile Edge senza alcuna specificità OS (Figura 5C). À u livellu metabolicu, cum'è mintuvatu sopra, per Nepenthes attenuatu, e sustanze chì rispondenu à u signale anu mostratu specificità OS è anu aumentatu significativamente δj, riducendu mentre Hj. Questu effettu di priming specificu di OS ùn hè statu rilevatu in spezie classificate cum'è spezie senza reazione à u signale (Figura 5, D è E). I metaboliti specifichi di l'OS sò spartuti più spessu trà e spezie chì rispondenu à u signale, è questi gruppi di signali si raggruppanu cù e spezie cù risposte di signale più debuli, mentre chì e spezie cù risposte di signale più debuli mostranu menu interdipendenza (Figura S8). Questu risultatu indica chì l'induzione specifica di l'OS di JA è a riconfigurazione specifica di l'OS di u metaboloma à valle sò accoppiate à u livellu di e spezie.
Dopu, avemu utilizatu una pasta di lanolina chì cuntene metil JA (MeJA) per trattà e piante per investigà se questi modi di accoppiamentu sò limitati da a dispunibilità di JA applicata da JA esogena, chì serà in u citoplasma di e piante. A deesterificazione rapida hè JA. Avemu trovu a stessa tendenza di u cambiamentu graduale da spezie chì rispondenu à u signale à spezie chì ùn rispondenu micca à u signale causata da a furnitura cuntinua di JA (Figura 5, D è E). In breve, u trattamentu MeJA hà fortemente riprogrammatu i metabolomi di nematodi lineari, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens, è N. mikimotoi, risultendu in un aumentu significativu di δj è una diminuzione di Hj. N. purpurea hà mostratu solu un aumentu di δj, ma micca Hj. N. obtusifolia, chì hè stata dimustrata prima di accumulà livelli estremamente bassi di JA, risponde ancu male à u trattamentu MeJA in termini di riconfigurazione di u metaboloma. Questi risultati indicanu chì a pruduzzione di JA o a trasduzione di u signale hè fisiologicamente limitata in spezie chì ùn rispondenu micca à u signale. Per pruvà sta ipotesi, avemu studiatu e quattru spezie (N. pallens, N. mills, N. pink è N. microphylla) indotte da W + W, W + OSM è W + OSS1 Transcriptome (39). In cunfurmità cù u mudellu di rimodellamentu di u metabolome, e spezie sò ben separate in u spaziu di u transcriptome, trà e quali N. attenuated hà mostratu u più altu RDPI induttu da OS, mentre chì N. gracilis avia u più bassu (Figura 6A). Tuttavia, hè statu trovu chì a diversità di u transcriptome indotta da N. oblonga era a più bassa trà e quattru spezie, cuntrariamente à a più alta diversità metabolomica di N. oblonga mostrata prima in sette spezie. Studi precedenti anu dimustratu chì un inseme di geni ligati à i primi signali di difesa, cumpresi i signali JA, spiega a specificità di e prime risposte di difesa indotte da elicitori ligati à l'erbivori in e spezie di Nicotiana (39). U paragone di e vie di segnalazione JA trà queste quattru spezie hà rivelatu un mudellu interessante (Figura 6B). A maiò parte di i geni in questa via, cum'è AOC, OPR3, ACX è COI1, anu mostratu livelli relativamente alti d'induzione in queste quattru spezie. Tuttavia, un genu chjave, JAR4, cunverte JA in a so forma biologicamente attiva di trascritti accumulati JA-Ile, è u so livellu di trascrizione hè assai bassu, in particulare in N. mills, Nepenthes pieris è N. microphylla. Inoltre, solu u trascritto di un altru genu AOS ùn hè statu rilevatu in N. bifidum. Questi cambiamenti in l'espressione genica ponu esse rispunsevuli di i fenotipi estremi indotti da a bassa pruduzzione di JA in e spezie anergiche di segnale è l'induzione di N. gracilis.
(A) Analisi di a teoria di l'infurmazione di a riprogrammazione di e risposte trascrizionali precoci di quattru spezie di tabacco strettamente correlate campionate 30 minuti dopu l'induzione erbivora. L'RDPI hè calculatu paragunendu e foglie indotte da l'OS erbivoru cù u cuntrollu di a ferita. I culori indicanu diverse spezie, è i simboli indicanu diversi metudi di trattamentu. (B) Analisi di l'espressione genica in e vie di segnalazione JA trà quattru spezie. U percorsu JA simplificatu hè mostratu accantu à u graficu à scatula. Diversi culori indicanu diversi metudi di trasfurmazione. L'asteriscu indica chì ci hè una differenza significativa trà u trattamentu W + OS è u cuntrollu W + W (per u test t di Student per e differenze à coppie, * P < 0,05, ** P < 0,01 è *** P < 0,001). OPDA, acidu 12-oxofitodienoicu; OPC-8: acidu 0,3-oxo-2 (2′ (Z) -pentenil) -ciclopentan-1-ottanoicu.
In l'ultima parte, avemu studiatu cumu u rimodellamentu specificu di e spezie d'insetti di u metaboloma di diverse spezie di piante pò esse resistente à l'erbivori. A ricerca precedente hà messu in risaltu u genaru Nicotiana. A so resistenza à Ms è à e larve hè assai diversa (40). Quì, avemu studiatu a cunnessione trà questu mudellu è a so plasticità metabolica. Usendu e quattru spezie di tabacco sopra menzionate, è testendu a currelazione trà a diversità è a specializazione di u metaboloma causata da l'erbivori è a resistenza di e piante à Ms è Sl, avemu trovu chì a resistenza, a diversità è a specializazione à u Sl generalista sò tutte pusitivamente correlate, mentre chì a currelazione trà a resistenza à e donne esperte è a specializazione hè debule, è a currelazione cù a diversità ùn hè micca significativa (Figura S10). In quantu à a resistenza S1, sia N. chinensis attenuata sia N. gracilis, chì sò stati prima dimustrati per esibisce sia livelli di trasduzione di u signale JA sia plasticità di u metaboloma, anu avutu risposte assai diverse à l'induzione di l'erbivori, è anu ancu mostratu una resistenza elevata simile. Sessu.
In l'ultimi sessanta anni, a teoria di a difesa di e piante hà furnitu un quadru teoricu, basatu annantu à u quale i circadori anu previstu un numeru considerableu di evoluzione è funzioni di metaboliti spezializati di e piante. A maiò parte di queste teorie ùn seguitanu micca a prucedura nurmale di inferenze forti (41). Pruponenu previsioni chjave (3) à u listessu livellu d'analisi. Quandu a prova di e previsioni chjave permette di analizà teorie specifiche, questu farà chì u campu avanza. Esse sustinutu, ma ricusate altre (42). Invece, a nova teoria face previsioni à diversi livelli d'analisi è aghjusta un novu stratu di cunsiderazioni descrittive (42). Tuttavia, e duie teorie pruposte à u livellu funziunale, MT è OD, ponu esse facilmente spiegate cum'è previsioni impurtanti di cambiamenti metabolichi spezializati causati da erbivori: a teoria OD crede chì i cambiamenti in u "spaziu" metabolicu spezializatu sò altamente direzionali. A teoria MT crede chì questi cambiamenti saranu non direzionali è situati à casu in u spaziu metabolicu, è tendenu à avè metaboliti di altu valore di difesa. L'esami precedenti di e previsioni OD è MT sò stati testati utilizendu un inseme strettu di cumposti di "difesa" a priori. Questi testi centrati nantu à i metaboliti impediscenu a capacità di analizà l'estensione è a traiettoria di a ricunfigurazione di u metaboloma durante l'erbivorìa, è ùn permettenu micca à i testi in un quadru statisticu coerente di richiede previsioni chjave chì ponu esse cunsiderate cum'è un inseme Quantificà i cambiamenti in u metaboloma di e piante. Quì, avemu utilizatu a tecnulugia innovativa in metabolomica basata nantu à MS computazionale è avemu realizatu analisi MS di deconvoluzione in a valuta generale di i descrittori di a teoria di l'infurmazione per testà a distinzione trà i dui pruposti à u livellu di a metabolomica globale. A predizione chjave di sta teoria. A teoria di l'infurmazione hè stata applicata in parechji campi, in particulare in u cuntestu di a biodiversità è a ricerca nantu à u flussu di nutrienti (43). Tuttavia, per ciò chì sapemu, questa hè a prima applicazione aduprata per discrive u spaziu d'infurmazione metabolica di e piante è risolve i prublemi ecologichi ligati à i cambiamenti metabolichi temporanei in risposta à i segnali ambientali. In particulare, a capacità di stu metudu stà in a so capacità di paragunà i mudelli in è trà e spezie vegetali per esaminà cumu l'erbivori si sò evoluti da diverse spezie à mudelli macroevolutivi interspecie à diversi livelli di evoluzione. Metabolismu.
L'analisi di i cumpunenti principali (PCA) cunverte un inseme di dati multivariati in un spaziu di riduzione di a dimensionalità in modu chì a tendenza principale di i dati pò esse spiegata, dunque hè generalmente aduprata cum'è una tecnica esplorativa per analizà l'inseme di dati, cum'è u metaboloma di deconvoluzione. Tuttavia, a riduzione di a dimensionalità perderà una parte di u cuntenutu di l'infurmazione in l'inseme di dati, è a PCA ùn pò micca furnisce informazioni quantitative nantu à e caratteristiche chì sò particularmente pertinenti à a teoria ecologica, cum'è: cumu l'erbivori riconfiguranu a diversità in campi specializati (per esempiu, ricchezza, distribuzione è abbundanza) metaboliti? Quali metaboliti sò predittori di u statu induttu di un datu erbivoru? Da a perspettiva di specificità, diversità è inducibilità, u cuntenutu di l'infurmazione di u prufilu di metaboliti specificu di a foglia hè decompostu, è si trova chì u manghjà di l'erbivori pò attivà un metabolismu specificu. Inaspettatamente, avemu osservatu chì, cum'è descrittu in l'indicatori di a teoria di l'infurmazione implementati, a situazione metabolica risultante hà una grande sovrapposizione dopu l'attacchi di i dui erbivori (u generalista alimentatu di notte Sl) è l'esperta di Solanaceae Ms. Ancu se u so cumpurtamentu alimentariu è a so cuncentrazione sò significativamente diversi. Iniziatore di cunjugatu di acidi grassi-aminoacidi (FAC) in OS (31). Utilizendu OS erbivoru per trattà ferite da puntura standardizate, u trattamentu simulatu di erbivori hà ancu mostratu una tendenza simile. Questa prucedura standardizata per simulà a risposta di e piante à l'attacchi di l'erbivori elimina i fattori di cunfusione causati da cambiamenti in u cumpurtamentu alimentariu di l'erbivori, chì portanu à diversi gradi di danni in tempi diversi (34). FAC, chì hè cunnisciutu per esse a causa principale di OSM, riduce JAS è altre risposte di ormoni vegetali in OSS1, mentre OSS1 si riduce centinaie di volte (31). Tuttavia, OSS1 hà causatu livelli simili di accumulazione di JA paragunatu à OSM. Hè statu dimustratu prima chì a risposta JA in Nepenthes attenuata hè assai sensibile à OSM, induve FAC pò mantene a so attività ancu s'ellu hè diluitu 1: 1000 cù acqua (44). Dunque, paragunatu à OSM, ancu se u FAC in OSS1 hè assai bassu, hè sufficiente per induce un focu sufficiente di JA. Studi precedenti anu dimustratu chì e proteine ​​simili à e porine (45) è l'oligosaccharidi (46) ponu esse aduprati cum'è indizii moleculari per scatenà risposte di difesa di e piante in OSS1. Tuttavia, ùn hè ancu chjaru se questi elicitori in OSS1 sò rispunsevuli di l'accumulazione di JA osservata in u studiu attuale.
Ancu s'ellu ci sò pochi studii chì descrivenu l'impronte digitali metaboliche differenziali causate da l'applicazione di diversi erbivori o JA o SA esogeni (acidu salicylicu) (47), nimu hà perturbatu a perturbazione specifica di a spezia erbivora in a rete di l'erba vegetale è i so effetti nantu à l'infurmazioni persunali specifiche. L'impattu generale di u metabolismu hè studiatu sistematicamente. Questa analisi hà cunfirmatu ancu chì a cunnessione di a rete ormonale interna cù altri ormoni vegetali diversi da i JA forma a specificità di a riurganizazione metabolica causata da l'erbivori. In particulare, avemu rilevatu chì l'ET causatu da OSM era significativamente più grande di quellu causatu da OSS1. Questa modalità hè coerente cù più cuntenutu FAC in OSM, chì hè una cundizione necessaria è sufficiente per scatenà un scoppiu ET (48). In u cuntestu di l'interazzione trà e piante è l'erbivori, a funzione di segnalazione di ET nantu à a dinamica di metaboliti specifichi di a pianta hè sempre sporadica è mira solu à un unicu gruppu di cumposti. Inoltre, a maiò parte di i studii anu utilizatu l'applicazione esogena di ET o di i so precursori o vari inibitori per studià a regulazione di ET, frà i quali queste applicazioni chimiche esogene pruduceranu parechji effetti secundari non specifici. À a nostra cunniscenza, questu studiu rapprisenta u primu esame sistematicu à grande scala di u rolu di l'ET in l'usu di l'ET per pruduce è percepisce piante transgeniche alterate per coordinà a dinamica di u metaboloma di e piante. L'induzione di l'ET specifica di l'erbivoru pò in fine modulà a risposta di u metaboloma. U più significativu hè a manipulazione transgenica di i geni di biosintesi di l'ET (ACO) è di percezione (ETR1) chì anu rivelatu l'accumulazione de novo di fenolamidi specifica di l'erbivoru. Hè statu dimustratu prima chì l'ET pò affinà l'accumulazione di nicotina indotta da JA regulendu a putrescina N-metiltransferasi (49). Tuttavia, da un puntu di vista meccanicu, ùn hè chjaru cumu l'ET affina l'induzione di a fenamide. In più di a funzione di trasduzione di u signale di l'ET, u flussu metabolicu pò ancu esse deviatu versu a S-adenosil-1-metionina per regulà l'investimentu in ammidi di poliaminofenoli. A S-adenosil-1-metionina hè l'ET è un intermediu cumunu di a via biosintetica di a poliammina. U mecanismu per u quale u signale ET regula u livellu di fenolamide hà bisognu di più studii.
Per un bellu pezzu, per via di u grande numeru di metaboliti speciali di struttura scunnisciuta, l'attenzione intensa à categurie metaboliche specifiche ùn hè stata capace di valutà strettamente i cambiamenti temporali di a diversità metabolica dopu l'interazzione biologiche. Attualmente, basatu annantu à l'analisi di a teoria di l'infurmazione, u risultatu principale di l'acquisizione di spettru MS/MS basata annantu à metaboliti imparziali hè chì l'erbivori chì manghjanu o simulanu erbivori cuntinueghjanu à riduce a diversità metabolica generale di u metaboloma fogliare mentre aumentanu u so gradu di specializazione. Questu aumentu tempurale di a specificità di u metaboloma causatu da l'erbivori hè assuciatu à un aumentu sinergicu di a specificità di u trascrittoma. A caratteristica chì cuntribuisce di più à sta più grande specializazione di u metaboloma (chì hà un valore Si più altu) hè u metabolitu speciale cù a funzione erbivora precedentemente carattarizata. Questu mudellu hè coerente cù a predizione di a teoria OD, ma a predizione di MT ligata à l'aleatorietà di a riprogrammazione di u metaboloma ùn hè micca coerente. Tuttavia, questi dati sò ancu coerenti cù a predizione di u mudellu mistu (migliore MT; Figura 1B), perchè altri metaboliti micca caratterizati cù funzioni di difesa scunnisciute ponu ancu seguità una distribuzione casuale di Si.
Un mudellu degne di nota ancu più catturatu da sta ricerca hè chì da u livellu di microevoluzione (una sola pianta è pupulazione di tabaccu) à una scala evolutiva più grande (spezie di tabaccu strettamente correlate), diversi livelli di urganizazione evolutiva sò in a "meglio difesa". Ci sò differenze significative in e capacità di l'erbivori. Moore et al. (20) è Kessler è Kalske (1) anu prupostu indipindentamente di cunvertisce i trè livelli funziunali di biodiversità originariamente distinti da Whittaker (50) in i cambiamenti temporali custitutivi è indotti di a diversità chimica; questi autori ùn anu nè riassuntu E procedure per a raccolta di dati metabolomi à grande scala ùn delineanu micca cumu calculà a diversità metabolica da questi dati. In questu studiu, picculi aghjustamenti à a classificazione funziunale di Whittaker cunsidereranu a diversità α-metabolica cum'è a diversità di i spettri MS/MS in una data pianta, è a diversità β-metabolica cum'è u metabolismu intraspecificu basicu di un gruppu di pupulazioni Spaziu, è a diversità γ-metabolica serà una estensione di l'analisi di spezie simili.
U signale JA hè essenziale per una larga gamma di risposte metaboliche di l'erbivori. Tuttavia, ci hè una mancanza di testi quantitativi rigorosi di u cuntributu di a regulazione intraspecifica di a biosintesi di JA à a diversità di u metaboloma, è se u signale JA hè un situ generale per a diversificazione metabolica indotta da u stress à una scala macroevolutiva più alta hè sempre sfuggente. Avemu osservatu chì a natura erbivora di Nepenthes erbivora induce a specializazione di u metaboloma è a variazione di a specializazione di u metaboloma in a pupulazione di e spezie di Nicotiana è trà e spezie di Nicotiana strettamente correlate hè sistematicamente correlata pusitivamente cù a segnalazione JA. Inoltre, quandu u signale JA hè alteratu, a specificità metabolica indotta da un unicu genotipu erbivoru serà annullata (Figura 3, C è E). Siccomu i cambiamenti di u spettru metabolicu di e pupulazioni di Nepenthes naturalmente attenuate sò per u più quantitativi, i cambiamenti in a diversità è a specificità β metabolica in questa analisi ponu esse in gran parte causati da a forte eccitazione di e categurie di cumposti ricchi di metaboliti. Queste classi di cumposti dominanu una parte di u prufilu di u metaboloma è portanu à una currelazione pusitiva cù i signali JA.
Siccomu i miccanismi biochimichi di e spezie di tabaccu strettamente ligate sò assai diffirenti, i metaboliti sò identificati specificamente in l'aspettu qualitativu, dunque hè più analiticu. U trattamentu di a teoria di l'infurmazione di u prufilu metabolicu catturatu rivela chì l'induzione erbivora aggrava u compromisu trà a diversità gamma metabolica è a specializazione. U signale JA ghjoca un rolu cintrali in questu compromisu. L'aumentu di a specializazione di u metaboloma hè coerente cù a principale previsione OD è hè pusitivamente correlata cù u signale JA, mentre chì u signale JA hè negativamente correlato cù a diversità gamma metabolica. Quessi mudelli indicanu chì a capacità OD di e piante hè principalmente determinata da a plasticità di JA, sia à scala microevolutiva sia à una scala evolutiva più grande. L'esperimenti esogeni di applicazione JA chì aggiranu i difetti di biosintesi JA rivelanu ancu chì e spezie di tabaccu strettamente ligate ponu esse distinte in spezie chì rispondenu à u segnale è spezie chì ùn rispondenu micca à u segnale, cum'è u so modu di JA è a plasticità di u metaboloma indotta da l'erbivori. E spezie chì ùn rispondenu micca à u segnale ùn ponu micca risponde per via di a so incapacità di pruduce JA endogena è sò dunque sottumesse à limitazioni fisiologiche. Questu pò esse causatu da mutazioni in certi geni chjave in a via di segnalazione JA (AOS è JAR4 in N. crescens). Stu risultatu mette in risaltu chì sti mudelli macroevolutivi interspecie ponu esse principalmente guidati da cambiamenti in a percezione è a reattività di l'ormoni interni.
In più di l'interazzione trà e piante è l'erbivori, l'esplorazione di a diversità metabolica hè ligata à tutti i progressi teorichi impurtanti in a ricerca di l'adattazione biologica à l'ambiente è l'evoluzione di tratti fenotipichi cumplessi. Cù l'aumentu di a quantità di dati acquistati da i strumenti MS muderni, i testi d'ipotesi nantu à a diversità metabolica ponu avà trascende e differenze di metaboliti individuali / di categuria è realizà analisi glubale per rivelà mudelli inaspettati. In u prucessu di analisi à grande scala, una metafora impurtante hè l'idea di cuncepisce carte significative chì ponu esse aduprate per esplorà i dati. Dunque, un risultatu impurtante di l'attuale cumbinazione di metabolomica MS / MS imparziale è teoria di l'infurmazione hè chì furnisce una metrica simplice chì pò esse aduprata per custruisce carte per navigà in a diversità metabolica nantu à diverse scale tassonomiche. Hè u requisitu basicu di stu metudu. U studiu di l'evoluzione micro / macro è l'ecologia di a cumunità.
À u livellu macroevolutivu, u core di a teoria di a coevoluzione pianta-insetti di Ehrlich è Raven (51) hè di prevede chì a variazione di a diversità metabolica interspecie hè a causa di a diversificazione di i lignaggi vegetali. Tuttavia, in i cinquanta anni dapoi a publicazione di questu travagliu seminale, sta ipotesi hè stata raramente testata (52). Questu hè in gran parte duvutu à e caratteristiche filogenetiche di caratteristiche metaboliche paragunabili in lignaggi vegetali à longa distanza. A rarità pò esse aduprata per ancorà i metudi d'analisi di u bersagliu. L'attuale flussu di travagliu MS/MS trattatu da a teoria di l'infurmazione quantifica a similitudine strutturale MS/MS di metaboliti scunnisciuti (senza una previa selezzione di metaboliti) è cunverte questi MS/MS in un inseme di MS/MS, cusì in u metabolismu prufessiunale questi mudelli macroevolutivi sò paragunati in scala di classificazione. Indicatori statistici simplici. U prucessu hè simile à l'analisi filogenetica, chì pò aduprà l'allineamentu di sequenze per quantificà u tassu di diversificazione o l'evoluzione di i caratteri senza previsione previa.
À u livellu biochimicu, l'ipotesi di screening di Firn è Jones (53) mostra chì a diversità metabolica hè mantenuta à diversi livelli per furnisce materie prime per esercità l'attività biologiche di metaboliti prima micca correlati o sustituiti. I metudi di a teoria di l'infurmazione furniscenu un quadru in u quale queste transizioni evolutive specifiche di i metaboliti chì si verificanu durante a specializazione di i metaboliti ponu esse quantificate cum'è parte di u prucessu di screening evolutivu prupostu: adattazione biologicamente attiva da bassa specificità à alta specificità Metaboliti inibiti di un ambiente datu.
In tuttu, à l'iniziu di a biologia moleculare, sò state sviluppate impurtanti teorie di difesa di e piante, è i metudi basati nantu à l'ipotesi deduttive sò largamente cunsiderati cum'è l'unicu mezzu di prugressu scientificu. Questu hè in gran parte duvutu à e limitazioni tecniche di a misurazione di tuttu u metaboloma. Ancu s'è i metudi basati nantu à l'ipotesi sò particularmente utili per sceglie altri meccanismi causali, a so capacità di fà avanzà a nostra comprensione di e rete biochimiche hè più limitata chè i metudi computazionali attualmente dispunibili in a scienza cuntempuranea à intensità di dati. Dunque, e teorie chì ùn ponu esse previste sò assai al di là di l'ambitu di i dati dispunibili, dunque a formula ipotetica / ciclu di test di prugressu in u campu di ricerca ùn pò esse abolita (4). Prevedemu chì u flussu di travagliu computazionale di a metabolomica introduttu quì pò riaccendere l'interessu per i prublemi recenti (cumu) è finali (perchè) di a diversità metabolica, è cuntribuisce à una nova era di scienza di dati guidata teoricamente. L'era hà riesaminatu e teorie impurtanti chì anu inspiratu e generazioni precedenti.
L'alimentazione diretta di l'erbivori hè realizata allevendu una larva di secondu stadiu o una larva Sl nantu à una sola foglia di pianta carnivora di culore pallidu di una sola pianta in fiore di rosa, cù 10 repliche di piante per pianta. E larve d'insetti sò state fissate cù pinze, è u tissutu fogliare restante hè statu raccoltu 24 è 72 ore dopu l'infezione è congelatu rapidamente, è i metaboliti sò stati estratti.
Simulà u trattamentu erbivoru in modu altamente sincronizatu. U metudu hè di utilizà rote di mudellu di tela per perforà trè file di spine da ogni latu di a nervatura centrale di e trè foglie cumpletamente espanse di a pianta durante a fase di crescita di a ghirlanda di tela, è applicà immediatamente 1:5 Diluted Ms. Oppure aduprà dite guantate per inserisce S1 OS in a ferita di puntura. Raccoglie è processà una foglia cum'è descrittu sopra. Aduprà u metudu descrittu prima per estrarre i metaboliti primari è l'ormoni vegetali (54).
Per l'applicazioni esogene di JA, e trè foglie picciolate di ognuna di e sei piante di rosa in fiore di ogni spezia sò trattate cù 20 μl di pasta di lanolina chì cuntene 150 μg di MeJA (Lan + MeJA), è 20 μl di lanolina più trattamentu per e ferite (Lan + W), o aduprate 20 μl di lanolina pura cum'è cuntrollu. E foglie sò state raccolte 72 ore dopu u trattamentu, congelate rapidamente in azotu liquidu è cunservate à -80 ° C finu à l'usu.
Quattru linee transgeniche JA è ET, vale à dì irAOC (36), irCOI1 (55), irACO è sETR1 (48), sò state identificate in u nostru gruppu di ricerca. irAOC hà mostratu una forte diminuzione di i livelli di JA è JA-Ile, mentre chì irCOI1 ùn era micca sensibile à i JA. In paragone cù EV, l'accumulazione di JA-Ile hè aumentata. In listessu modu, irACO riducerà a pruduzzione di ET, è in paragone cù EV, sETR1, chì hè insensibile à ET, aumenterà a pruduzzione di ET.
Un spettrometru laser fotoacustico (sensore ET in tempu reale Sensor Sense ETD-300) hè utilizatu per realizà a misurazione ET in modu non invasivu. Subitu dopu u trattamentu, a metà di e foglie sò state tagliate è trasferite in una fiala di vetru sigillata di 4 ml, è u spaziu di testa hè statu lasciatu accumulà in 5 ore. Durante a misurazione, ogni fiala hè stata lavata cù un flussu di 2 litri/ora d'aria pura per 8 minuti, chì era passata prima per un catalizatore furnitu da Sensor Sense per rimuovere CO2 è acqua.
I dati di u microarray sò stati publicati in origine in (35) è salvati in a basa di dati cumpleta di l'espressione genica di u Centru Naziunale per l'Informazione Biotecnologica (NCBI) (numeru d'accessu GSE30287). I dati currispondenti à e foglie causate da u trattamentu W + OSMs è u cuntrollu senza danni sò stati estratti per questu studiu. L'intensità grezza hè log2. Prima di l'analisi statistica, a linea di basa hè stata cunvertita è nurmalizzata à u so 75esimu percentile utilizendu u pacchettu software R.
I dati originali di sequenziamentu di l'ARN (RNA-seq) di e spezie di Nicotiana sò stati recuperati da l'NCBI Short Reading Archives (SRA), u numeru di prughjettu hè PRJNA301787, chì hè statu riportatu da Zhou et al. (39) è si procede cum'è descrittu in (56). I dati grezzi trattati da W + W, W + OSM è W + OSS1 currispondenti à e spezie di Nicotiana sò stati selezziunati per l'analisi in questu studiu, è trattati in u modu seguente: Prima, e letture grezze di RNA-seq sò state cunvertite in furmatu FASTQ. HISAT2 cunverte FASTQ in SAM, è SAMtools cunverte i fugliali SAM in fugliali BAM ordinati. StringTie hè adupratu per calculà l'espressione genica, è u so metudu d'espressione hè chì ci sò frammenti per milla frammenti di basi per milione di frammenti di trascrizione sequenziati.
A colonna cromatografica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; dimensione di e particelle 2,2 μm) aduprata in l'analisi è a colonna di guardia 4 mm x 4 mm sò custituite da u listessu materiale. U seguente gradiente binariu hè adupratu in u sistema di cromatografia liquida à alte prestazioni (UHPLC) Dionex UltiMate 3000: da 0 à 0,5 minuti, isocraticu 90% A [acqua deionizzata, 0,1% (v/v) acetonitrile è 0,05% acidu formicu], 10% B (acetonitrile è 0,05% acidu formicu); da 0,5 à 23,5 minuti, a fase di gradiente hè rispettivamente 10% A è 90% B; da 23,5 à 25 minuti, isocraticu 10% A è 90% B. A velocità di flussu hè di 400 μl/min. Per tutte l'analisi MS, iniettate l'eluente di a colonna in un analizzatore quadrupolare è à tempu di volu (qTOF) equipatu cù una fonte d'elettrospray chì funziona in modu di ionizazione pusitiva (tensione capillare, 4500 V; uscita capillare 130 V; Temperatura di asciugatura 200 °C; flussu d'aria di asciugatura 10 litri / min).
Eseguite l'analisi di frammenti MS/MS (in seguitu denominata MS/MS) chì hè irrilevante o indistinguibile da i dati per ottene informazioni strutturali nantu à u prufilu metabolicu generale rilevabile. U cuncettu di u metudu MS/MS indiscriminatu si basa nantu à u fattu chì u quadrupolo hà una finestra d'isolamentu di massa assai grande [dunque, cunsiderate tutti i signali di rapportu massa-carica (m/z) cum'è frammenti]. Per questa ragione, postu chì u strumentu Impact II ùn hè statu capace di creà una inclinazione CE, parechje analisi indipendenti sò state realizate utilizendu valori aumentati di l'energia di collisione (CE) indotta da collisione. In breve, prima analizate u campione per ionizazione UHPLC-elettrospray/qTOF-MS utilizendu a modalità di spettrometria di massa unica (condizioni di bassa frammentazione generate da a frammentazione in-source), scansione da m/z 50 à 1500 à una frequenza di ripetizione di 5 Hz. Aduprate l'azotu cum'è gas di collisione per l'analisi MS/MS, è eseguite misurazioni indipendenti à e seguenti quattru diverse tensioni di dissociazione indotta da collisione: 20, 30, 40 è 50 eV. In tuttu u prucessu di misurazione, u quadrupolo hà a più grande finestra d'isolamentu di massa, da m/z 50 à 1500. Quandu l'esperimentu di larghezza d'isolamentu è m/z di u corpu frontale hè impostu à 200, a gamma di massa hè attivata automaticamente da u software operativu di u strumentu è 0 Da. Scansione per frammenti di massa cum'è in modu di massa unica. Aduprate formiatu di sodiu (50 ml d'isopropanolu, 200 μl d'acidu formicu è 1 ml di soluzione acquosa 1M NaOH) per a calibrazione di massa. Usendu l'algoritmu di calibrazione d'alta precisione di Bruker, u schedariu di dati hè calibratu dopu avè eseguitu u spettru mediu in un periodu di tempu datu. Aduprate a funzione d'esportazione di u software Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Germania) per cunvertisce i schedarii di dati grezzi in furmatu NetCDF. U set di dati MS/MS hè statu salvatu in a basa di dati aperta di metabolomica MetaboLights (www.ebi.ac.uk) cù u numeru d'accessu. MTBLS1471.
L'assemblaggio MS/MS pò esse realizatu per mezu di l'analisi di currelazione trà i signali di qualità MS1 è MS/MS per l'energia di collisione bassa è alta è e regule appena implementate. U script R hè utilizatu per realizà l'analisi di currelazione di a distribuzione di u precursore à u pruduttu, è u script C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) hè utilizatu per implementà e regule.
Per riduce l'errori falsi pusitivi causati da u rumore di fondu è a falsa currelazione causata da a rilevazione di certe caratteristiche m/z in solu uni pochi di campioni, usemu a funzione "piccu pienu" di u pacchettu R XCMS (per a currezzione di u rumore di fondu) Deve esse aduprata per rimpiazzà l'intensità "NA" (piccu micca rilevatu). Quandu si usa a funzione di piccu pienu, ci sò sempre parechji valori d'intensità "0" in u set di dati chì influenzeranu u calculu di a currelazione. Dopu, paragunemu i risultati di l'elaborazione di dati ottenuti quandu si usa a funzione di piccu pienu è quandu ùn si usa micca a funzione di piccu pienu, è calculemu u valore di u rumore di fondu basatu annantu à u valore stimatu mediu currettu, è dopu rimpiazzemu questi valori d'intensità 0 cù u valore di fondu calculatu. Avemu ancu cunsideratu solu e caratteristiche chì a so intensità hà superatu trè volte u valore di fondu è li avemu cunsiderati cum'è "picchi veri". Per i calculi PCC, solu i signali m/z di u precursore di u campione (MS1) è i set di dati di frammenti cù almenu ottu picchi veri sò cunsiderati.
Sè l'intensità di a caratteristica di qualità di u precursore in tuttu u campione hè significativamente correlata cù l'intensità ridutta di a stessa caratteristica di qualità chì hè sottumessa à una energia di collisione bassa o alta, è a caratteristica ùn hè micca etichettata cum'è un piccu isotopicu da CAMERA, pò esse definita più in dettagliu. Dopu, calculendu tutte e pussibili coppie precursore-produttu in 3 s (a finestra di tempu di ritenzione stimata per a ritenzione di u piccu), l'analisi di currelazione hè realizata. Solu quandu u valore m/z hè più bassu di u valore di u precursore è a frammentazione MS/MS si verifica in a stessa locu di u campione in u set di dati cum'è u precursore da u quale hè derivatu, hè cunsideratu un frammentu.
Basatu annantu à ste duie regule simplici, escludimu i frammenti specificati cù valori m/z più grandi di l'm/z di u precursore identificatu, è basatu annantu à a pusizione di u campione induve appare u precursore è u frammentu specificatu. Hè ancu pussibule di selezziunà e caratteristiche di qualità generate da parechji frammenti in-source generati in modu MS1 cum'è precursori candidati, generendu cusì cumposti MS/MS ridondanti. Per riduce sta ridondanza di dati, se a similitudine NDP di i spettri supera 0,6, è appartenenu à u cromatogramma "pcgroup" annotatu da CAMERA, li fusioneremu. Infine, fusionemu tutti i quattru risultati CE assuciati à u precursore è i frammenti in u spettru cumpostu deconvolutu finale selezziunendu u piccu di più alta intensità trà tutti i picchi candidati cù u listessu valore m/z à diverse energie di collisione. I passi di trasfurmazione successivi sò basati annantu à u cuncettu di spettru cumpostu è tenenu contu di e diverse cundizioni CE necessarie per massimizà a probabilità di frammentazione, perchè alcuni frammenti ponu esse rilevati solu sottu una energia di collisione specifica.
RDPI (30) hè statu utilizatu per calculà l'inducibilità di u prufilu metabolicu. A diversità di u spettru metabolicu (indice Hj) hè derivata da l'abbundanza di precursori MS/MS utilizendu l'entropia di Shannon di a distribuzione di frequenza MS/MS utilizendu l'equazione seguente descritta da Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) induve Pij currisponde à a frequenza relativa di l'i-esimu MS/MS in u j-esimu campione (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2,…, m) t).
A specificità metabolica (indice Si) hè definita cum'è l'identità d'espressione di un MS/MS datu in relazione à a frequenza trà i campioni cunsiderati. A specificità MS/MS hè calculata cum'è Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Aduprate a formula seguente per misurà l'indice δj specificu di u metaboloma di ogni campione j, è a media di a specificità MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
I spettri MS/MS sò alliniati in coppie, è a similitudine hè calculata basendu si nantu à i dui punteggi. Prima, aduprendu NDP standard (cunnisciutu ancu cum'è metudu di currelazione di u cosinu), aduprate l'equazione seguente per puntuà a similitudine di u segmentu trà i spettri NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 induve S1 è S2 Currispundentementi, per u spettru 1 è u spettru 2, è ancu WS1, i è WS2, i rapprisenta u pesu basatu annantu à l'intensità di u piccu chì a differenza di l'i-esimu piccu cumunu trà i dui spettri hè menu di 0,01 Da. U pesu hè calculatu cusì: W = [intensità di u piccu] m [qualità] n, m = 0,5, n = 2, cum'è suggeritu da MassBank.
Un secondu metudu di puntuazione hè statu implementatu, chì implicava l'analisi di a NL spartuta trà MS/MS. À questu scopu, avemu utilizatu e 52 liste NL incontrate spessu durante u prucessu di frammentazione MS in tandem, è a NL più specifica (file di dati S1) chì hè stata annotata prima per u spettru MS/MS di i metaboliti secundarii di e spezie di Nepenthes indebulite (9, 26). Crea un vettore binariu di 1 è 0 per ogni MS/MS, currispondente rispettivamente à l'attuale è à l'inesistente di qualchì NL. Basatu annantu à a similitudine di distanza euclidea, u puntu di similitudine NL hè calculatu per ogni coppia di vettori NL binari.
Per fà un clustering duale, avemu utilizatu u pacchettu R DiffCoEx, chì hè basatu annantu à una estensione di Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Utilizendu e matrici di puntuazione NDP è NL di i spettri MS/MS, avemu utilizatu DiffCoEx per calculà a matrice di currelazione comparativa. U clustering binariu hè realizatu impostendu u parametru "cutreeDynamic" à method = "hybrid", cutHeight = 0.9999, deepSplit = T, è minClusterSize = 10. U codice surghjente R di DiffCoEx hè statu telecaricatu da u schedariu supplementariu 1 da Tesson et al. (57); U pacchettu software R WGCNA necessariu pò esse truvatu in https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Per fà l'analisi di rete moleculare MS/MS, avemu calculatu a connettività spettrale appaiata basata annantu à i tipi di similarità NDP è NL, è avemu utilizatu u software Cytoscape per visualizà a topologia di a rete utilizendu u layout organicu in l'applicazione di estensione di l'algoritmu di layout yFiles CyFilescape.
Aduprate a versione 3.0.1 di R per fà analisi statistiche di i dati. A significatività statistica hè stata valutata aduprendu l'analisi di varianza à duie vie (ANOVA), seguita da u test post-hoc di differenza onestamente significativa (HSD) di Tukey. Per analizà a differenza trà u trattamentu erbivoru è u cuntrollu, a distribuzione à duie code di i dui gruppi di campioni cù a stessa varianza hè stata analizata aduprendu u test t di Student.
Per materiali supplementari per questu articulu, per piacè vede http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
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A teoria di l'infurmazione furnisce una valuta universale per a paragone di metabolomi speciali è a predizione di teorie di difesa di test.
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