L'articulu face parte di u tema di ricerca "Migliurà a resistenza di i legumi à i patogeni è i parassiti", vede tutti i 5 articuli
L'agente causale di a necrosi fungina di e piante Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary usa una strategia à più livelli per infettà diverse piante ospiti. Stu studiu propone l'usu di a diamina L-ornitina, un aminoacidu non proteicu chì stimula a sintesi di altri aminoacidi essenziali, cum'è una strategia di gestione alternativa per migliurà e risposte moleculari, fisiologiche è biochimiche di Phaseolus vulgaris L. à a muffa bianca causata da Pseudomonas sclerotiorum. Esperimenti in vitro anu dimustratu chì L-ornitina hà inibitu significativamente a crescita miceliale di S. pyrenoidosa in modu dose-dipendente. Inoltre, puderia riduce significativamente a gravità di a muffa bianca in cundizioni di serra. Inoltre, L-ornitina hà stimulatu a crescita di e piante trattate, indicendu chì e concentrazioni testate di L-ornitina ùn eranu micca fitotossiche per e piante trattate. Inoltre, a L-ornitina hà aumentatu l'espressione di antioxidanti non enzimatici (fenoli è flavonoidi totali solubili) è antioxidanti enzimatici (catalasi (CAT), perossidasi (POX) è polifenolo ossidasi (PPO)), è hà aumentatu l'espressione di trè geni correlati à l'antioxidanti (PvCAT1, PvSOD è PvGR). Inoltre, l'analisi in silico hà rivelatu a presenza di una presunta proteina ossalacetato acetidrolasi (SsOAH) in u genomu di S. sclerotiorum, chì era assai simile à e proteine ​​ossalacetato acetidrolasi (SsOAH) di Aspergillus fijiensis (AfOAH) è Penicillium sp. (PlOAH) in termini di analisi funzionale, duminii cunservati è topologia. Hè interessante nutà chì l'aggiunta di L-ornitina à u mediu di brodu di destrosio di patata (PDB) hà diminuitu significativamente l'espressione di u genu SsOAH in i miceli di S. sclerotiorum. In listessu modu, l'applicazione esogena di L-ornitina hà diminuitu significativamente l'espressione di u genu SsOAH in i miceli fungini raccolti da e piante trattate. Infine, l'applicazione di L-ornitina hà diminuitu significativamente a secrezione di l'acidu ossalicu sia in u mezu PDB sia in e foglie infettate. In conclusione, L-ornitina ghjoca un rolu chjave in u mantenimentu di u statu redox è ancu in u miglioramentu di a risposta di difesa di e piante infettate. I risultati di questu studiu ponu aiutà à sviluppà metudi innovativi è rispettosi di l'ambiente per cuntrullà a muffa bianca è mitigà u so impattu nantu à a pruduzzione di fagioli è altre culture.
A muffa bianca, causata da u fungu necrotroficu Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, hè una malatia devastante chì riduce u rendimentu è chì rapprisenta una seria minaccia per a pruduzzione mundiale di fagioli (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum hè unu di i patogeni fungini di e piante trasmessi da u terrenu i più difficiuli da cuntrullà, cù una larga gamma di ospiti di più di 600 spezie di piante è a capacità di macerà rapidamente i tessuti ospiti in modu non specificu (Liang è Rollins, 2018). In cundizioni sfavurevuli, subisce una fase critica di u so ciclu di vita, rimanendu dormiente per longhi periodi di tempu cum'è strutture nere, dure, simili à semi chjamate "sclerozia" in u terrenu o cum'è crescite bianche è soffici in u miceliu o in u midollu di u fustu di e piante infettate (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum hè capace di furmà sclerozi, ciò chì li permette di sopravvive in campi infettati per longhi periodi di tempu è di persiste durante a malatia (Schwartz et al., 2005). I sclerozi sò ricchi di nutrienti, ponu persiste in u terrenu per longhi periodi è servenu cum'è inoculu primariu per infezioni successive (Schwartz et al., 2005). In cundizioni favurevuli, i sclerozi germinanu è producenu spore trasportate da l'aria chì ponu infettà tutte e parti sopraelevate di a pianta, cumprese, ma senza limitazione, fiori, steli o baccelli (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum usa una strategia à più livelli per infettà e so piante ospiti, chì implica una seria d'eventi cuurdinati da a germinazione scleroziale à u sviluppu di i sintomi. Inizialmente, S. sclerotiorum produce spore sospese (chjamate ascospore) da strutture simili à funghi chjamate apoteci, chì diventanu trasportate da l'aria è si sviluppanu in sclerozi non mobili nantu à i detriti vegetali infettati (Bolton et al., 2006). U fungu secerne tandu l'acidu ossalicu, un fattore di virulenza, per cuntrullà u pH di a parete cellulare di a pianta, prumove a degradazione enzimatica è l'invasione di i tessuti (Hegedus è Rimmer, 2005), è supprime u scoppiu ossidativu di a pianta ospitante. Stu prucessu di acidificazione indebulisce a parete cellulare di a pianta, furnendu un ambiente favurevule per u funziunamentu nurmale è efficiente di l'enzimi di degradazione di a parete cellulare fungina (CWDE), permettendu à l'agente patogenu di superà a barriera fisica è di penetrà in i tessuti ospiti (Marciano et al., 1983). Una volta penetratu, S. sclerotiorum secreta un certu numeru di CWDE, cum'è a poligalatturonasi è a cellulasi, chì facilitanu a so disseminazione in i tessuti infettati è causanu necrosi tissutale. A progressione di e lesioni è di i tappetini ifali porta à i sintomi caratteristici di a muffa bianca (Hegedus è Rimmer, 2005). Intantu, e piante ospiti ricunnoscenu i mudelli moleculari assuciati à i patogeni (PAMP) attraversu i receptori di ricunniscenza di mudelli (PRR), scatenendu una seria di eventi di segnalazione chì infine attivanu e risposte di difesa.
Malgradu decennii di sforzi per u cuntrollu di e malatie, a scarsità di germoplasma resistente adeguatu ferma in u fasgiolu, cum'è in altre culture cummirciali, per via di a resistenza, a sopravvivenza è l'adattabilità di l'agente patogenu. A gestione di e malatie hè dunque estremamente difficiule è richiede una strategia integrata è multiforme chì include una cumbinazione di pratiche culturali, cuntrollu biologicu è fungicidi chimichi (O'Sullivan et al., 2021). U cuntrollu chimicu di a muffa bianca hè u più efficace perchè i fungicidi, quandu sò applicati currettamente è à u mumentu ghjustu, ponu cuntrullà efficacemente a diffusione di a malatia, riduce a gravità di l'infezzione è minimizà e perdite di rendimentu. Tuttavia, l'usu eccessivu è a dipendenza eccessiva da i fungicidi ponu purtà à l'emergenza di ceppi resistenti di S. sclerotiorum è avè un impattu negativu nantu à l'organismi non bersaglio, a salute di u terrenu è a qualità di l'acqua (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Dunque, truvà alternative rispettose di l'ambiente hè diventata una priorità assoluta.
E poliamine (PA), cum'è a putrescina, a spermidina, a spermina è a cadaverina, ponu serve cum'è alternative promettenti contr'à i patogeni vegetali trasmessi da u terrenu, riducendu cusì cumpletamente o parzialmente l'usu di fungicidi chimichi periculosi (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). In e piante superiori, l'PA sò implicati in parechji prucessi fisiologichi, cumpresi, ma micca limitati à, a divisione cellulare, a differenziazione è a risposta à stress abiotici è biotici (Killiny è Nehela, 2020). Puderanu agisce cum'è antioxidanti, aiutà à eliminà e spezie reattive di l'ossigenu (ROS), mantene l'omeostasi redox (Nehela è Killiny, 2023), induce geni ligati à a difesa (Romero et al., 2018), regulà diverse vie metaboliche (Nehela è Killiny, 2023), modulà i fitormoni endogeni (Nehela è Killiny, 2019), stabilisce una resistenza sistemica acquisita (SAR) è regulà l'interazioni pianta-patogenu (Nehela è Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Vale a pena nutà chì i meccanismi specifici è i roli di l'AP in a difesa di e piante varianu secondu e spezie vegetali, i patogeni è e cundizioni ambientali. L'AP più abbundante in e piante hè biosintetizzata da a poliammina essenziale L-ornitina (Killiny è Nehela, 2020).
L-ornitina ghjoca parechji roli in a crescita è u sviluppu di e piante. Per esempiu, studii precedenti anu dimustratu chì in u risu (Oryza sativa), l'ornitina pò esse assuciata à u riciclaggio di l'azotu (Liu et al., 2018), u rendimentu, a qualità è l'aroma di u risu (Lu et al., 2020), è a risposta à u stress idricu (Yang et al., 2000). Inoltre, l'applicazione esogena di L-ornitina hà aumentatu significativamente a tolleranza à a siccità in a barbabietola da zuccheru (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) è hà alleviatu u stress salinu in e piante di cipolla (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu è Çavuşoǧlu, 2021) è di anacardiu (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). U putenziale rolu di L-ornitina in a difesa da u stress abioticu pò esse duvutu à a so implicazione in l'accumulazione di prolina in e piante trattate. Per esempiu, i geni ligati à u metabolismu di a prolina, cum'è i geni di l'ornitina delta aminotransferasi (delta-OAT) è di a prolina deidrogenasi (ProDH1 è ProDH2), sò stati digià signalati cum'è implicati in a difesa di Nicotiana benthamiana è Arabidopsis thaliana contr'à i ceppi di Pseudomonas syringae micca ospiti (Senthil-Kumar è Mysore, 2012). D’altronde, l’ornitina decarbossilasi fungina (ODC) hè necessaria per a crescita di l’agenti patogeni (Singh et al., 2020). U targeting di l'ODC di Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via u silenziamentu geneticu induttu da l’ospite (HIGS) hà aumentatu significativamente a resistenza di e piante di pumata à l’appassimentu di Fusarium (Singh et al., 2020). Tuttavia, u rolu putenziale di l’applicazione esogena di l’ornitina contr'à i stress biotici cum'è i fitopatogeni ùn hè statu ben studiatu. Più impurtante, l'effetti di l'ornitina nantu à a resistenza à e malatie è i fenomeni biochimichi è fisiologichi assuciati restanu in gran parte inesplorati.
Capisce a cumplessità di l'infezzione di S. sclerotiorum di i legumi hè impurtante per u sviluppu di strategie di cuntrollu efficaci. In questu studiu, avemu vulsutu identificà u rolu putenziale di a diamina L-ornitina cum'è fattore chjave in u rinfurzamentu di i meccanismi di difesa è a resistenza di e piante di legumi à l'infezzione di Sclerotinia sclerotiorum. Ipotizzemu chì, in più di rinfurzà e risposte di difesa di e piante infettate, L-ornitina ghjoca ancu un rolu chjave in u mantenimentu di u statu redox. Pruponemu chì l'effetti putenziali di L-ornitina sò ligati à a regulazione di i meccanismi di difesa antioxidanti enzimatici è non enzimatici è l'interferenza cù i fattori di patogenicità/virulenza fungina è e proteine ​​associate. Questa doppia funzionalità di L-ornitina a rende una candidata promettente per una strategia sustenibile per mitigà l'impattu di a muffa bianca è migliurà a resistenza di e culture di legumi cumuni à questu putente patogenu funginu. I risultati di u presente studiu ponu aiutà à u sviluppu di metudi innovativi è rispettosi di l'ambiente per cuntrullà a muffa bianca è mitigà u so impattu nantu à a pruduzzione di legumi.
In questu studiu, una varietà cummerciale suscettibile di fagiolu cumunu, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), hè stata aduprata cum'è materiale sperimentale. Semi sani sò stati furniti gentilmente da u Dipartimentu di Ricerca di Leguminose, Istitutu di Ricerca di e Culture in Campu (FCRI), Centru di Ricerca Agricola (ARC), Egittu. Cinque sementi sò state suminate in vasi di plastica (diametru internu 35 cm, prufundità 50 cm) pieni di terra infettata da S. sclerotiorum in cundizioni di serra (25 ± 2 °C, umidità relativa 75 ± 1%, 8 ore di luce / 16 ore di bughjura). À 7-10 ghjorni dopu a semina (DPS), e piantine sò state diradate per lascià solu duie piantine cù una crescita uniforme è trè foglie cumpletamente espanse in ogni vaso. Tutte e piante in vaso sò state annaffiate una volta ogni duie settimane è fertilizate mensilmente à a tarifa raccomandata per a varietà data.
Per preparà una cuncentrazione di 500 mg/L di L-ornitinadiamina (cunnisciuta ancu cum'è acidu (+)-(S)-2,5-diaminopentanoicu; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), 50 mg sò stati prima dissolti in 100 mL d'acqua distillata sterile. A suluzione madre hè stata poi diluita è aduprata in esperimenti successivi. In breve, sei serie di cuncentrazioni di L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 è 125 mg/L) sò state testate in vitro. Inoltre, l'acqua distillata sterile hè stata aduprata cum'è cuntrollu negativu (Mock) è u fungicida cummerciale "Rizolex-T" 50% polvere bagnabile (toclofos-metile 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egittu) hè statu adupratu cum'è cuntrollu pusitivu. U fungicida cummerciale "Rizolex-T" hè statu testatu in vitro à cinque concentrazioni (2, 4, 6, 8 è 10 mg/L).
Campioni di steli è baccelli di fagioli cumuni chì mostranu sintomi tipici di muffa bianca (tassu d'infestazione: 10-30%) sò stati raccolti da aziende agricole cummerciali. Ancu s'è a maiò parte di i materiali vegetali infettati sò stati identificati per spezie/varietà (varietà cummerciale suscettibile Giza 3), altri, in particulare quelli ottenuti da i mercati lucali, eranu di spezie scunnisciute. I materiali infettati raccolti sò stati prima disinfettati in superficia cù una soluzione di ipocloritu di sodiu à 0,5% per 3 minuti, poi sciacquati parechje volte cù acqua distillata sterile è asciugati cù carta da filtru sterile per rimuovere l'acqua in eccessu. L'organi infettati sò stati poi tagliati in picculi pezzi da u tissutu mediu (trà i tessuti sani è infettati), cultivati ​​​​​​in mezu di agar destrosio di patata (PDA) è incubati à 25 ± 2 °C cù un ciclu di 12 ore di luce/12 ore di bughjura per 5 ghjorni per stimulà a furmazione di sclerozi. U metudu di a punta miceliale hè statu ancu utilizatu per purificà isolati fungini da culture miste o contaminate. L'isolatu funginu purificatu hè statu prima identificatu in basa à e so caratteristiche morfologiche culturali è poi cunfirmatu cum'è S. sclerotiorum in basa à caratteristiche microscopiche. Infine, tutti l'isolati purificati sò stati testati per a patogenicità nantu à a cultivar di fagioli cumuni suscettibile Giza 3 per risponde à i postulati di Koch.
Inoltre, l'isolatu di S. sclerotiorum u più invasivu (isolatu #3) hè statu cunfirmatu ulteriormente basatu annantu à u sequenziamentu di u spacer trascritto internu (ITS) cum'è descrittu da White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. In breve, l'isolati sò stati cultivati ​​in brodu di destrosio di patata (PDB) è incubati à 25 ± 2 °C per 5-7 ghjorni. U miceliu funginu hè statu poi raccoltu, filtratu attraversu una garza, lavatu duie volte cù acqua sterile è asciugatu cù carta da filtru sterile. U DNA genomicu hè statu isolatu utilizendu u Kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). A regione ITS rDNA hè stata dopu amplificata aduprendu a coppia specifica di primer ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; dimensione prevista: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). I prudutti PCR purificati sò stati sottumessi per u sequenziamentu (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). E sequenze di ITS rDNA sò state sequenziate bidirezionalmente aduprendu u metudu di sequenziamentu Sanger. E sequenze query assemblate sò state dopu paragunate cù l'ultimi dati in GenBank è u Centru Naziunale per l'Informazione Biotecnologica (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) aduprendu u software BLASTn. A sequenza query hè stata paragunata cù altri 20 ceppi/isolati di S. sclerotiorum recuperati da l'ultimi dati in NCBI GenBank (Tabella Supplementare S1) aduprendu ClustalW in u Pacchettu di Analisi Genetica Evolutiva Moleculare (MEGA-11; versione 11) (Kumar et al., 2024). L'analisi evolutiva hè stata realizata aduprendu u metudu di a massima verosimiglianza è u mudellu generale di sustituzione di nucleotidi reversibile in u tempu (Nei è Kumar, 2000). L'arburu cù a più alta log-verosimiglianza hè mostratu. L'arburu iniziale per a ricerca euristica hè sceltu scegliendu l'arburu cù a più alta log-verosimiglianza trà l'arburu neighbor-joining (NJ) (Kumar et al., 2024) è l'arburu di massima parsimonia (MP). L'arburu NJ hè statu custruitu aduprendu una matrice di distanza à coppie calculata aduprendu u mudellu generale reversibile in u tempu (Nei è Kumar, 2000).
L'attività antibatterica di L-ornitina è di u battericida "Rizolex-T" hè stata determinata in vitro cù u metudu di diffusione in agar. Metudu: Pigliate a quantità adatta di a suluzione stock di L-ornitina (500 mg/L) è mischiate bè cù 10 ml di u mezu nutritivu PDA per preparà suluzioni cù cuncentrazioni finali di 12,5, 25, 50, 75, 100 è 125 mg/L, rispettivamente. Cinque cuncentrazioni di u fungicida "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 è 10 mg/L) è acqua distillata sterile sò state aduprate cum'è cuntrollu. Dopu chì u mezu s'hè solidificatu, un tappu miceliale appena preparatu di cultura di Sclerotinia sclerotiorum, di 4 mm di diametru, hè statu trasferitu à u centru di a piastra di Petri è cultivatu à 25±2°C finu à chì u miceliu hà cupertu tutta a piastra di Petri di cuntrollu, dopu à chì a crescita fungina hè stata registrata. Calculate a percentuale d'inibizione di a crescita radiale di S. sclerotiorum aduprendu l'equazione 1:
L'esperimentu hè statu ripetutu duie volte, cù sei repliche biologiche per ogni gruppu di cuntrollu/sperimentale è cinque vasi (duie piante per vasettu) per ogni replica biologica. Ogni replica biologica hè stata analizata duie volte (duie repliche tecniche) per assicurà l'accuratezza, l'affidabilità è a riproducibilità di i risultati sperimentali. Inoltre, l'analisi di regressione probit hè stata aduprata per calculà a cuncentrazione inibitoria à metà massima (IC50) è l'IC99 (Prentice, 1976).
Per valutà u putenziale di a L-ornitina in cundizioni di serra, sò stati realizati dui esperimenti consecutivi in ​​vasi. In breve, i vasi sò stati pieni di terra argillosa-sabbiosa sterilizzata (3:1) è inoculati cù una cultura appena preparata di S. sclerotiorum. Prima, l'isolatu più invasivu di S. sclerotiorum (isolatu #3) hè statu cultivatu tagliendu un scleroziu à a mità, piazzendulu à faccia in giù nantu à un PDA è incubandu à 25 °C in bughjura costante (24 ore) per 4 ghjorni per stimulà a crescita miceliale. Quattru tappi d'agar di 5 mm di diametru sò stati poi presi da u bordu d'attaccu è inoculati cù 100 g di una mistura sterile di crusca di granu è di risu (1:1, v/v) è tutti i fiaschi sò stati incubati à 25 ± 2 °C sottu un ciclu di 12 ore di luce/12 ore di bughjura per 5 ghjorni per stimulà a furmazione di sclerozii. U cuntenutu di tutti i fiaschi hè statu mischiatu accuratamente per assicurà l'omogeneità prima di aghjunghje a terra. Dopu, 100 g di a mistura di crusca colonizzante hè stata aghjunta à ogni pignatta per assicurà una cuncentrazione costante di patogeni. I pignatti inoculati sò stati innaffiati per attivà a crescita fungina è posti in serra per 7 ghjorni.
Cinque semi di a varietà Giza 3 sò stati poi suminati in ogni vasettu. Per i vasi trattati cù L-ornitina è u fungicida Rizolex-T, i semi sterilizzati sò stati prima immersi per duie ore in una soluzione acquosa di i dui cumposti cù una concentrazione finale di IC99 di circa 250 mg/L è 50 mg/L, rispettivamente, è poi asciugati à l'aria per un'ora prima di a semina. D’altronde, i semi sò stati immersi in acqua distillata sterile cum'è cuntrollu negativu. Dopu à 10 ghjorni, prima di a prima irrigazione, e piantine sò state diradate, lascendu solu duie piantine pulite in ogni vasettu. Inoltre, per assicurà l'infezzione cù S. sclerotiorum, i steli di e piante di fagioli in u listessu stadiu di sviluppu (10 ghjorni) sò stati tagliati in dui lochi diversi aduprendu un bisturi sterilizatu è circa 0,5 g di a mistura di crusca colonizzante hè stata piazzata in ogni ferita, seguita da alta umidità per stimulà l'infezzione è u sviluppu di a malatia in tutte e piante inoculate. E piante di cuntrollu sò state ferite in modu simile è una quantità uguale (0,5 g) di mistura di crusca sterile è micca colonizzata hè stata posta in a ferita è mantenuta in cundizioni di alta umidità per simulà l'ambiente per u sviluppu di a malatia è assicurà a coerenza trà i gruppi di trattamentu.
Metudu di trattamentu: E piantine di fagioli sò state innaffiate cù 500 ml di una soluzione acquosa di L-ornitina (250 mg/l) o di u fungicida Rizolex-T (50 mg/l) irrigendu u terrenu, dopu u trattamentu hè statu ripetutu trè volte à un intervallu di 10 ghjorni. I cuntrolli trattati cù placebo sò stati irrigati cù 500 ml d'acqua distillata sterile. Tutti i trattamenti sò stati effettuati in cundizioni di serra (25 ± 2°C, 75 ± 1% umidità relativa è un fotoperiodu di 8 ore di luce/16 ore di bughjura). Tutti i vasi sò stati innaffiati ogni duie settimane è trattati mensilmente cù un fertilizante NPK equilibratu (20-20-20, cù 3,6% di zolfu è microelementi TE; Zain Seeds, Egittu) à una cuncentrazione di 3-4 g/l per spruzzatura fogliare secondu e raccomandazioni per a varietà specifica è l'istruzzioni di u fabricatore. Salvo indicazione contraria, e foglie mature cumpletamente espanse (2a è 3a foglia da cima) sò state raccolte da ogni replica biologica à 72 ore dopu u trattamentu (hpt), omogeneizzate, raggruppate è conservate à -80 °C per ulteriori analisi, cumprese, ma senza limitazione, a lucalizazione istochimica in situ di indicatori di stress ossidativu, a perossidazione lipidica, l'antioxidanti enzimatici è non enzimatici è l'espressione genica.
L'intensità di l'infezzione da a muffa bianca hè stata valutata settimanalmente 21 ghjorni dopu l'inoculazione (dpi) utilizendu una scala da 1 à 9 (Tabella Supplementare S2) basata annantu à a scala Petzoldt è Dickson (1996) mudificata da Teran et al. (2006). In breve, i steli è i rami di e piante di fagioli sò stati esaminati cuminciendu da u puntu di inoculazione per seguità a progressione di e lesioni longu l'internodi è i nodi. A distanza di a lesione da u puntu di inoculazione à u puntu più luntanu longu u stelu o u ramu hè stata poi misurata è un puntuatu da 1 à 9 hè statu assignatu basatu annantu à a situazione di a lesione, induve (1) ùn indicava alcuna infezzione visibile vicinu à u puntu di inoculazione è (2-9) indicava un aumentu graduale di a dimensione di a lesione è di a progressione longu i nodi/internodi (Tabella Supplementare S2). L'intensità di l'infezzione da a muffa bianca hè stata poi cunvertita in percentuale utilizendu a formula 2:
Inoltre, l'area sottu à a curva di progressione di a malattia (AUDPC) hè stata calculata aduprendu a formula (Shaner è Finney, 1977), chì hè stata recentemente adattata per a putrefazione bianca di u fagiolu cumunu (Chauhan et al., 2020) aduprendu l'equazione 3:
Induve Yi = gravità di a malatia à u tempu ti, Yi+1 = gravità di a malatia à u prossimu tempu ti+1, ti = ora di a prima misurazione (in ghjorni), ti+1 = ora di a prossima misurazione (in ghjorni), n = numeru tutale di punti di tempu o punti d'osservazione. I parametri di crescita di e piante di fagioli, cumprese l'altezza di a pianta (cm), u numeru di rami per pianta è u numeru di foglie per pianta, sò stati registrati settimanalmente per 21 ghjorni in tutte e repliche biologiche.
In ogni replica biologica, i campioni di foglie (seconda è terza foglia cumpletamente sviluppata da a cima) sò stati raccolti u ghjornu 45 dopu u trattamentu (15 ghjorni dopu l'ultimu trattamentu). Ogni replica biologica era custituita da cinque vasi (duie piante per vasu). Circa 500 mg di u tissutu schiacciatu sò stati utilizati per l'estrazione di pigmenti fotosintetici (clorofilla a, clorofilla b è carotenoidi) utilizendu 80% acetone à 4 °C in u bughju. Dopu à 24 ore, i campioni sò stati centrifugati è u surnatante hè statu raccoltu per a determinazione di u cuntenutu di clorofilla a, clorofilla b è carotenoidi culurimetricamente utilizendu un spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone) secondu u metudu di (Lichtenthaler, 1987) misurendu l'assorbanza à trè diverse lunghezze d'onda (A470, A646 è A663 nm). Infine, u cuntenutu di pigmenti fotosintetici hè statu calculatu utilizendu e seguenti formule 4-6 descritte da Lichtenthaler (1987).
À 72 ore dopu à u trattamentu (hpt), e foglie (seconda è terza foglia cumpletamente sviluppata da a cima) sò state raccolte da ogni replica biologica per a lucalizazione istochimica in situ di u perossidu d'idrogenu (H2O2) è di l'anione superossidu (O2•−). Ogni replica biologica era custituita da cinque vasi (duie piante per vaso). Ogni replica biologica hè stata analizata in duplicatu (duie repliche tecniche) per assicurà a precisione, l'affidabilità è a riproducibilità di u metudu. H2O2 è O2•− sò stati determinati aduprendu 0,1% 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) o nitroblu tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), rispettivamente, seguendu i metudi descritti da Romero-Puertas et al. (2004) è Adam et al. (1989) cù modifiche minori. Per a lucalizazione istochimica di H2O2 in situ, i fogliolini sò stati infiltrati sottu vuoto cù 0,1% DAB in tampone Tris 10 mM (pH 7,8) è poi incubati à temperatura ambiente à a luce per 60 minuti. I fogliolini sò stati sbiancati in 0,15% (v/v) TCA in etanolu:cloroformiu 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egittu) è poi esposti à a luce finu à chì si sò scuriti. In listessu modu, e valve sò state infiltrate sottu vuoto cù 10 mM di tampone fosfatu di potassiu (pH 7,8) chì cuntene 0,1 w/v % HBT per a lucalizazione istochimica di O2•− in situ. I fogliolini sò stati incubati à a luce à temperatura ambiente per 20 minuti, poi sbiancati cum'è sopra, è poi illuminati finu à chì sò apparse macchie blu scuru/viola. L'intensità di u culore marrone risultante (cum'è indicatore H2O2) o blu-viola (cum'è indicatore O2•−) hè stata valutata aduprendu a versione Fiji di u pacchettu di trasfurmazione d'imagine ImageJ (http://fiji.sc; accessu u 7 di marzu di u 2024).
A malondialdeide (MDA; cum'è marcatore di perossidazione lipidica) hè stata determinata secondu u metudu di Du è Bramlage (1992) cù lievi mudificazioni. E foglie di ogni replica biologica (seconda è terza foglia cumpletamente sviluppata da a cima) sò state raccolte 72 ore dopu u trattamentu (hpt). Ogni replica biologica includeva cinque vasi (duie piante per vaso). Ogni replica biologica hè stata analizata in duplicatu (duie repliche tecniche) per assicurà a precisione, l'affidabilità è a riproducibilità di u metudu. In breve, 0,5 g di tissutu fogliare macinatu sò stati utilizati per l'estrazione di MDA cù 20% di acidu tricloroaceticu (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) chì cuntene 0,01% di idrossitoluene butilatu (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). U cuntenutu di MDA in u surnatante hè statu dopu determinatu culurimetricamente misurendu l'assorbanza à 532 è 600 nm utilizendu un spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone) è dopu espressu cum'è nmol g−1 FW.
Per a valutazione di l'antioxidanti non enzimatici è enzimatici, e foglie (seconda è terza foglia cumpletamente sviluppata da cima) sò state raccolte da ogni replica biologica à 72 ore dopu u trattamentu (hpt). Ogni replica biologica era custituita da cinque vasi (duie piante per vaso). Ogni campione biologicu hè statu analizatu in duplicatu (duie campioni tecnichi). Duie foglie sò state macinate cù azotu liquidu è aduprate direttamente per a determinazione di l'antioxidanti enzimatici è non enzimatici, l'aminoacidi totali, u cuntenutu di prolina, l'espressione genica è a quantificazione di l'ossalatu.
I fenoli totali solubili sò stati determinati cù u reagente Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) cù lievi mudificazioni di u metudu discrittu da Kahkonen et al. (1999). In breve, circa 0,1 g di tissutu fogliare omogeneizatu hè statu estrattu cù 20 ml di metanolu à l'80% in u bughju per 24 ore è u supernatante hè statu raccoltu dopu a centrifugazione. 0,1 ml di l'estrattu di campione hè statu mischiatu cù 0,5 ml di reagente Folin-Ciocalteu (10%), scuzzulatu per 30 s è lasciatu in u bughju per 5 minuti. Dopu, 0,5 ml di soluzione di carbonatu di sodiu à u 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egittu) hè statu aghjuntu à ogni tubu, mischiatu bè è incubatu à temperatura ambiente in u bughju per 1 ora. Dopu l'incubazione, l'assorbanza di a mistura di reazione hè stata misurata à 765 nm aduprendu un spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). A cuncentrazione di fenoli totali solubili in l'estratti di u campione hè stata determinata aduprendu una curva di calibrazione di l'acidu gallicu (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) è espressa cum'è milligrammi di equivalente di acidu gallicu per grammu di pesu frescu (mg GAE g-1 pesu frescu).
U cuntenutu tutale di flavonoidi solubili hè statu determinatu secondu u metudu di Djeridane et al. (2006) cù lievi mudificazioni. In breve, 0,3 ml di l'estrattu di metanolu sopra hè statu mischiatu cù 0,3 ml di soluzione di cloruru d'aluminiu à 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), agitatu vigorosamente è poi incubatu à temperatura ambiente per 5 minuti, seguitu da l'aggiunta di 0,3 ml di soluzione di acetatu di potassiu à 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egittu), mischiatu accuratamente è incubatu à temperatura ambiente per 30 minuti à u bughju. Dopu l'incubazione, l'assorbanza di a mistura di reazione hè stata misurata à 430 nm utilizendu un spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). A cuncentrazione di flavonoidi solubili totali in estratti di campioni hè stata determinata utilizendu una curva di calibrazione di rutina (TCI America, Portland, OR, USA) è poi espressa cum'è milligrammi di equivalente di rutina per grammu di pesu frescu (mg RE g-1 pesu frescu).
U cuntenutu tutale di aminoacidi liberi di e foglie di fagioli hè statu determinatu aduprendu un reagente di ninidrina mudificatu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) basatu annantu à u metudu prupostu da Yokoyama è Hiramatsu (2003) è mudificatu da Sun et al. (2006). In breve, 0,1 g di tissutu macinatu hè statu estrattu cù un buffer pH 5,4, è 200 μL di u surnatante sò stati fatti reagisce cù 200 μL di ninidrina (2%) è 200 μL di piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), incubati in un bagnu d'acqua bollente per 30 minuti, poi raffreddati è misurati à 580 nm aduprendu un spettrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Giappone). D’altronde, a prolina hè stata determinata cù u metudu Bates (Bates et al., 1973). A prolina hè stata estratta cù 3% d'acidu sulfosalicylicu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) è dopu a centrifugazione, 0,5 ml di u surnatante hè statu mischiatu cù 1 ml d'acidu aceticu glaciale (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) è u reagente ninidrina, incubatu à 90 °C per 45 min, raffreddato è misurato à 520 nm utilizendu u listessu spettrofotometru cum'è sopra. L'aminoacidi liberi totali è a prolina in l'estratti di foglie sò stati determinati utilizendu curve di calibrazione di glicina è prolina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), rispettivamente, è espressi cum'è mg / g di pesu frescu.
Per determinà l'attività enzimatica di l'enzimi antioxidanti, circa 500 mg di tissutu omogeneizatu sò stati estratti cù 3 ml di buffer Tris 50 mM (pH 7,8) chì cuntene 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) è 7,5% di polivinilpirrolidone (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), centrifugati à 10.000 × g per 20 minuti in refrigerazione (4 °C), è u surnatante (estrattu enzimaticu grezzu) hè statu raccoltu (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A catalasi (CAT) hè stata tandu fatta reagisce cù 2 ml di tampone fosfatu di sodiu 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) è 100 μl di soluzione H2O2 269 mM per determinà a so attività enzimatica secondu u metudu di Aebi (1984) cù lievi mudificazioni (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). L'attività enzimatica di a perossidasi dipendente da u guaiacol (POX) hè stata determinata aduprendu u metudu di Harrach et al. (2009). (2008) cù mudificazioni minori (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) è l'attività enzimatica di a polifenol ossidasi (PPO) hè stata determinata dopu a reazione cù 2,2 ml di tampone fosfatu di sodiu 100 mM (pH 6,0), 100 μl di guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) è 100 μl di H2O2 12 mM. U metudu hè statu ligeramente mudificatu da (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). U test hè statu realizatu dopu a reazione cù 3 ml di soluzione di catecolu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) preparata di frescu in tampone fosfatu 0,1 M (pH 6,0). L'attività CAT hè stata misurata monitorizendu a decomposizione di H2O2 à 240 nm (A240), l'attività POX hè stata misurata monitorizendu l'aumentu di l'assorbanza à 436 nm (A436), è l'attività PPO hè stata misurata registrendu e fluttuazioni di l'assorbanza à 495 nm (A495) ogni 30 s per 3 min utilizendu un spettrofotometru UV-160A (Shimadzu, Giappone).
A RT-PCR in tempu reale hè stata aduprata per rilevà i livelli di trascrizione di trè geni ligati à l'antioxidanti, cumprese a catalasi peroxisomale (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), a superossido dismutasi (PvSOD; GenBank Accession No. XM_068639556.1), è a glutatione reduttasi (PvGR; GenBank Accession No. KY195009.1), in foglie di fagiolo (a seconda è a terza foglia cumpletamente sviluppata da cima) 72 ore dopu l'ultimu trattamentu. In breve, l'ARN hè statu isolatu aduprendu Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Cina) secondu u protocolu di u fabricatore. Dopu, u cDNA hè statu sintetizatu aduprendu TOP script™ cDNA Synthesis Kit secondu l'istruzzioni di u fabricatore. E sequenze di primer di i trè geni sopra sò elencate in a Tabella Supplementare S3. PvActin-3 (numeru d'accessu GenBank: XM_068616709.1) hè statu utilizatu cum'è genu di mantenimentu è l'espressione genica relativa hè stata calculata utilizendu u metudu 2-ΔΔCT (Livak è Schmittgen, 2001). A stabilità di l'actina sottu stress bioticu (interazione incompatibile trà i legumi cumuni è u fungu antracnosi Colletotrichum lindemuthianum) è stress abioticu (siccità, salinità, bassa temperatura) hè stata dimustrata (Borges et al., 2012).
Inizialmente avemu realizatu un'analisi in silico à livellu di genomu di e proteine ​​di l'oxaloacetatu acetillidrolasi (OAH) in S. sclerotiorum utilizendu u strumentu proteina-proteina BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). In breve, avemu utilizatu OAH da Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; numeru d'accessu GenBank XP_040799428.1; 342 aminoacidi) è Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; numeru d'accessu GenBank XP_056833920.1; 316 aminoacidi) cum'è sequenze di query per mappà a proteina omologa in S. sclerotiorum (taxide: 5180). BLASTp hè statu realizatu contr'à i dati di u genomu di S. sclerotiorum più recenti dispunibili in GenBank nantu à u situ web di u Centru Naziunale per l'Infurmazione Biotecnologica (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Inoltre, u genu OAH previstu da S. sclerotiorum (SsOAH) è l'analisi evolutiva è l'arburu filogeneticu di AfOAH da A. fijiensis CBS 313.89 è PlOAH da P. lagena sò stati dedutti utilizendu u metudu di massima probabilità in MEGA11 (Tamura et al., 2021) è u mudellu basatu nantu à a matrice JTT (Jones et al., 1992). L'arburu filogeneticu hè statu cumminatu cù l'analisi di allineamentu multiplu di e sequenze di proteine ​​di tutti i geni OAH previsti (SsOAH) da S. sclerotiorum è a sequenza di query utilizendu u Strumentu di Allineamentu Basatu nantu à e Vincoli (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos è Agarwala, 2007). Inoltre, e sequenze di aminoacidi più currispondenti di SsOAH da S. sclerotiorum sò state allineate cù e sequenze di query (AfOAH è PlOAH) (Larkin et al., 2007) utilizendu ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), è e regioni cunservate in l'allineamentu sò state visualizate utilizendu u strumentu ESPript (versione 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Inoltre, i duminii rappresentativi funziunali previsti è i siti cunservati di S. sclerotiorum SsOAH sò stati classificati interattivamente in diverse famiglie utilizendu u strumentu InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Infine, a modellazione di a struttura tridimensionale (3D) di u S. sclerotiorum SsOAH previstu hè stata realizata utilizendu u Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 server version 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) è validata utilizendu u server SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). E strutture tridimensionali previste (furmatu PDB) sò state visualizate interattivamente cù u pacchettu UCSF-Chimera (versione 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
A PCR quantitativa in fluorescenza in tempu reale hè stata aduprata per determinà u livellu trascrizionale di l'oxaloacetatu acetillidrolasi (SsOAH; numeru d'accessu GenBank: XM_001590428.1) in i miceli di Sclerotinia sclerotiorum. In breve, S. sclerotiorum hè statu inoculatu in un matrazzu chì cuntene PDB è piazzatu in un incubatore agitatu (mudellu: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) à 25 ± 2 °C per 24 ore à 150 rpm è in bughjura costante (24 ore) per stimulà a crescita miceliale. In seguitu, e cellule sò state trattate cù L-ornitina è u fungicida Rizolex-T à concentrazioni finali di IC50 (circa 40 è 3,2 mg/L, rispettivamente) è poi cultivate per altre 24 ore in e stesse cundizioni. Dopu l'incubazione, e culture sò state centrifugate à 2500 rpm per 5 minuti è u surnatante (miceliu funginu) hè statu raccoltu per l'analisi di l'espressione genica. In listessu modu, u miceliu funginu hè statu raccoltu à 0, 24, 48, 72, 96 è 120 ore dopu l'infezione da e piante infettate chì avianu furmatu muffa bianca è miceliu cuttuniosu nantu à a superficia di i tessuti infettati. L'ARN hè statu estrattu da u miceliu funginu è dopu u cDNA hè statu sintetizatu cum'è descrittu sopra. E sequenze di primer per SsOAH sò elencate in a Tabella Supplementare S3. SsActin (numeru d'accessu GenBank: XM_001589919.1) hè statu utilizatu cum'è genu di mantenimentu, è l'espressione genica relativa hè stata calculata utilizendu u metudu 2-ΔΔCT (Livak è Schmittgen, 2001).
L'acidu ossalicu hè statu determinatu in u brodu di destrosio di patata (PDB) è in campioni di piante chì cuntenenu u patogenu fungicu Sclerotinia sclerotiorum secondu u metudu di Xu è Zhang (2000) cù lievi mudificazioni. In breve, l'isolati di S. sclerotiorum sò stati inoculati in fiaschi chì cuntenenu PDB è dopu cultivati ​​in un incubatore agitatu (mudellu I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) à 150 rpm à 25 ± 2 °C per 3-5 ghjorni in bughjura costante (24 h) per stimulà a crescita miceliale. Dopu l'incubazione, a cultura fungina hè stata prima filtrata attraversu carta da filtru Whatman #1 è dopu centrifugata à 2500 rpm per 5 minuti per rimuovere u miceliu residuale. U surnatante hè statu raccoltu è cunservatu à 4 °C per un'ulteriore determinazione quantitativa di ossalatu. Per a preparazione di campioni di piante, circa 0,1 g di frammenti di tissutu vegetale sò stati estratti trè volte cù acqua distillata (2 ml ogni volta). I campioni sò stati poi centrifugati à 2500 rpm per 5 minuti, u surnatante hè statu filtratu à seccu attraversu carta da filtru Whatman n. 1 è raccoltu per analisi ulteriori.
Per l'analisi quantitativa di l'acidu ossalicu, a mistura di reazione hè stata preparata in un tubu cù tappu di vetru in u seguente ordine: 0,2 ml di campione (o filtratu di cultura PDB o soluzione standard di acidu ossalicu), 0,11 ml di blu di bromofenolo (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml di acidu sulfuricu 1 M (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egittu) è 0,176 ml di dicromatu di potassiu 100 mM (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), è dopu a soluzione hè stata diluita à 4,8 ml cù acqua distillata, mischiata vigorosamente è immediatamente posta in un bagnu d'acqua à 60 °C. Dopu à 10 minuti, a reazione hè stata fermata aghjunghjendu 0,5 ml di soluzione di idrossidu di sodiu (NaOH; 0,75 M). L'assorbanza (A600) di a mistura di reazione hè stata misurata à 600 nm aduprendu un spettrofotometru UV-160 (Shimadzu Corporation, Giappone). U PDB è l'acqua distillata sò stati aduprati cum'è cuntrolli per a quantificazione di i filtrati di cultura è di i campioni di piante, rispettivamente. E concentrazioni di acidu ossalicu in i filtrati di cultura, espresse cum'è microgrammi di acidu ossalicu per millilitru di mezu PDB (μg.mL−1), è in l'estratti di foglie, espresse cum'è microgrammi di acidu ossalicu per grammu di pesu frescu (μg.g−1 FW), sò state determinate aduprendu una curva di calibrazione di l'acidu ossalicu (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
In tuttu u studiu, tutti l'esperimenti sò stati cuncipiti in un disignu cumpletamente aleatoriu (CRD) cù sei repliche biologiche per trattamentu è cinque vasi per replica biologica (duie piante per vasu) salvu indicazione contraria. E repliche biologiche sò state analizate in duplicatu (duie repliche tecniche). E repliche tecniche sò state aduprate per verificà a riproducibilità di u listessu esperimentu, ma ùn sò state aduprate in l'analisi statistica per evità repliche spurie. I dati sò stati analizati statisticamente aduprendu l'analisi di a varianza (ANOVA) seguita da u test di differenza significativamente significativa (HSD) di Tukey-Kramer (p ≤ 0,05). Per l'esperimenti in vitro, i valori IC50 è IC99 sò stati calculati aduprendu u mudellu probit è sò stati calculati intervalli di cunfidenza à 95%.
Un totale di quattru isolati sò stati raccolti da diversi campi di soia in u guvernatoratu di El Ghabiya, in Egittu. Nantu à u mezu PDA, tutti l'isolati anu pruduttu miceliu biancu cremosu chì hè diventatu rapidamente biancu cotonoso (Figura 1A) è dopu beige o marrone à u stadiu di scleroziu. I sclerozi sò generalmente densi, neri, sferichi o di forma irregulare, longhi da 5,2 à 7,7 mm è di diametru da 3,4 à 5,3 mm (Figura 1B). Ancu s'è quattru isolati anu sviluppatu un mudellu marginale di sclerozi à u bordu di u mezu di cultura dopu à 10-12 ghjorni d'incubazione à 25 ± 2 °C (Fig. 1A), u numeru di sclerozi per piastra era significativamente differente trà di elli (P < 0,001), cù l'isolatu 3 chì avia u numeru più altu di sclerozi (32,33 ± 1,53 sclerozi per piastra; Fig. 1C). In listessu modu, l'isulatu #3 hà pruduttu più acidu ossalicu in PDB chè altri isolati (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). L'isulatu #3 hà mostratu caratteristiche morfologiche è microscopiche tipiche di u fungu fitopatogenu Sclerotinia sclerotiorum. Per esempiu, nantu à PDA, e culonie di l'isulatu #3 sò cresciute rapidamente, eranu biancu crema (Figura 1A), beige inversu o giallu-marrone salmone chjaru, è anu necessitatu 6-7 ghjorni à 25 ± 2°C per copre cumpletamente a superficia di una piastra di 9 cm di diametru. Basatu annantu à e caratteristiche morfologiche è microscopiche sopra, l'isulatu #3 hè statu identificatu cum'è Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Caratteristiche è patogenicità di l'isolati di S. sclerotiorum da e culture cumuni di leguminose. (A) Crescita miceliale di quattru isolati di S. sclerotiorum nantu à u mediu PDA, (B) sclerozi di quattru isolati di S. sclerotiorum, (C) numeru di sclerozi (per piastra), (D) secrezione di acidu ossalicu nantu à u mediu PDB (μg.mL−1), è (E) gravità di a malatia (%) di quattru isolati di S. sclerotiorum nantu à a cultivar cummerciale di leguminose Giza 3 suscettibile in cundizioni di serra. I valori rapprisentanu a media ± SD di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicanu differenze statisticamente significative trà i trattamenti (p < 0,05). (F–H) Sintomi tipici di muffa bianca sò apparsi rispettivamente nantu à i steli è e silique sopraelevate, 10 ghjorni dopu l'inoculazione cù l'isolatu #3 (dpi). (I) L'analisi evolutiva di a regione di u spacer trascritto internu (ITS) di l'isolatu #3 di S. sclerotiorum hè stata realizata utilizendu u metudu di a massima verosimiglianza è paragunata cù 20 isolati/ceppi di riferimentu ottenuti da a basa di dati di u Centru Naziunale per l'Informazione Biotecnologica (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). I numeri sopra à e linee di clustering indicanu a cupertura di a regione (%), è i numeri sottu à e linee di clustering indicanu a lunghezza di u ramu.
Inoltre, per cunfirmà a patogenicità, quattru isolati di S. sclerotiorum ottenuti sò stati aduprati per inoculà a cultivar di fagioli cummerciale suscettibile Giza 3 in cundizioni di serra, ciò chì hè coerente cù i postulati di Koch (Fig. 1E). Ancu s'è tutti l'isolati fungini ottenuti eranu patogeni è pudianu infettà u fagiolu verde (cv. Giza 3), causendu sintomi tipici di muffa bianca in tutte e parti sopraelevate (Fig. 1F), in particulare nantu à i steli (Fig. 1G) è i baccelli (Fig. 1H) à 10 ghjorni dopu l'inoculazione (dpi), l'isolatu 3 era l'isolatu u più aggressivu in dui esperimenti indipendenti. L'isolatu 3 avia a più alta gravità di a malattia (%) nantu à e piante di fagioli (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 è 76,7 ± 3,1 à 7, 14 è 21 ghjorni dopu l'infezione, rispettivamente; Figura 1F).
L'identificazione di l'isulatu #3 di S. sclerotiorum u più invasivu hè stata ulteriormente cunfirmata in basa à u sequenziamentu di u spacer trascritto internu (ITS) (Fig. 1I). L'analisi filogenetica trà l'isulatu #3 è 20 isolati/ceppi di riferimentu hà mostratu una alta similitudine (>99%) trà di elli. Vale a pena nutà chì l'isulatu #3 di S. sclerotiorum (533 bp) hà una alta similitudine cù l'isulatu americanu di S. sclerotiorum LPM36 isolatu da semi di piselli secchi (numeru d'accessu GenBank MK896659.1; 540 bp) è l'isulatu cinese di S. sclerotiorum YKY211 (numeru d'accessu GenBank OR206374.1; 548 bp), chì provoca a putrefazione di u fustu violetu (Matthiola incana), chì sò tutti raggruppati separatamente in cima à u dendrogramma (Figura 1I). A nova sequenza hè stata dipusitata in a basa di dati NCBI è chjamata "Sclerotinia sclerotiorum - isolatu YN-25" (numeru d'accessu GenBank PV202792). Si pò vede chì l'isolatu 3 hè l'isolatu u più invasivu; dunque, questu isolatu hè statu sceltu per u studiu in tutti l'esperimenti successivi.
L'attività antibatterica di a diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania) à diverse concentrazioni (12,5, 25, 50, 75, 100 è 125 mg/L) contr'à l'isolatu 3 di S. sclerotiorum hè stata studiata in vitro. Hè da nutà chì a L-ornitina hà esercitatu un effettu antibattericu è hà inibitu gradualmente a crescita radiale di l'ife di S. sclerotiorum in modu dose-dipendente (Figura 2A, B). À a più alta concentrazione testata (125 mg/L), a L-ornitina hà dimustratu u più altu tassu d'inibizione di a crescita micelia (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), chì era equivalente à u fungicida cummerciale Rizolex-T (tassu d'inibizione 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) à a più alta concentrazione testata (10 mg/L), indicendu una efficacia simile.
Figura 2. Attività antibatterica in vitro di L-ornitina contr'à Sclerotinia sclerotiorum. (A) Paragone di l'attività antibatterica di diverse concentrazioni di L-ornitina contr'à S. sclerotiorum cù u fungicida cummerciale Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Tassu d'inibizione (%) di a crescita miceliale di S. sclerotiorum dopu u trattamentu cù diverse concentrazioni di L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 è 125 mg/L) o Rizolex-T (2, 4, 6, 8 è 10 mg/L), rispettivamente. I valori rapprisentanu a media ± SD di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse denotanu differenze statistiche trà i trattamenti (p < 0,05). (D, E) Analisi di regressione di u mudellu probit di L-ornitina è di u fungicida cummerciale Rizolex-T, rispettivamente. A linea di regressione di u mudellu probit hè mostrata cum'è una linea blu cuntinua, è l'intervallu di cunfidenza (95%) hè mostratu cum'è una linea rossa tratteggiata.
Inoltre, hè stata realizata un'analisi di regressione probit è i grafici currispondenti sò mostrati in a Tavula 1 è in e Figure 2D,E. In breve, u valore di pendenza accettabile (y = 2,92x − 4,67) è e statistiche significative associate (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 è p < 0,0001; Figura 2D) di L-ornitina anu indicatu una attività antifungina migliorata contr'à S. sclerotiorum paragunata à u fungicida cummerciale Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 è p < 0,0001) (Tavula 1).
Tavula 1. Valori di a cuncentrazione inibitoria à metà massima (IC50) è IC99 (mg/l) di L-ornitina è fungicida cummerciale "Rizolex-T" contr'à S. sclerotiorum.
In generale, a L-ornitina (250 mg/L) hà riduttu significativamente u sviluppu è a gravità di a muffa bianca nantu à e piante di fagioli cumuni trattate paragunatu à e piante infettate da S. sclerotiorum micca trattate (cuntrollu; Figura 3A). In breve, ancu s'è a gravità di a malatia di e piante di cuntrollu infettate micca trattate hè aumentata gradualmente (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, è 92,33 ± 3,06%), a L-ornitina hà riduttu significativamente a gravità di a malatia (%) in tuttu l'esperimentu (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00, è 26,36 ± 3,07) à 7, 14, è 21 ghjorni dopu u trattamentu (dpt), rispettivamente (Figura 3A). In listessu modu, quandu e piante di fagioli infettate da S. sclerotiorum sò state trattate cù 250 mg/L L-ornitina, l'area sottu à a curva di progressione di a malattia (AUDPC) hè diminuita da 1274,33 ± 33,13 in u cuntrollu micca trattatu à 281,03 ± 7,95, chì era ligeramente inferiore à quella di u cuntrollu pusitivu 50 mg/L Rizolex-T fungicida (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). A stessa tendenza hè stata osservata in u secondu esperimentu.
Fig. 3. Effettu di l'applicazione esogena di L-ornitina nantu à u sviluppu di a putrefazione bianca di u fagiolu cumunu causata da Sclerotinia sclerotiorum in cundizioni di serra. (A) Curva di progressione di a malatia di a muffa bianca di u fagiolu cumunu dopu u trattamentu cù 250 mg/L di L-ornitina. (B) Area sottu à a curva di progressione di a malatia (AUDPC) di a muffa bianca di u fagiolu cumunu dopu u trattamentu cù L-ornitina. I valori rapprisentanu a media ± SD di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse denotanu differenze statisticamente significative trà i trattamenti (p < 0,05).
L'applicazione esogena di 250 mg/L di L-ornitina hà aumentatu gradualmente l'altezza di a pianta (Fig. 4A), u numeru di rami per pianta (Fig. 4B) è u numeru di foglie per pianta (Fig. 4C) dopu à 42 ghjorni. Mentre u fungicida cummerciale Rizolex-T (50 mg/L) hà avutu u più grande effettu nantu à tutti i parametri nutrizionali studiati, l'applicazione esogena di 250 mg/L di L-ornitina hà avutu u secondu più grande effettu paragunatu à i cuntrolli micca trattati (Fig. 4A-C). Da l'altra parte, u trattamentu cù L-ornitina ùn hà avutu nisun effettu significativu nant'à u cuntenutu di pigmenti fotosintetici clorofilla a (Fig. 4D) è clorofilla b (Fig. 4E), ma hà aumentatu ligeramente u cuntenutu tutale di carotenoidi (0,56 ± 0,03 mg/g pesu fr) paragunatu à u cuntrollu negativu (0,44 ± 0,02 mg/g pesu fr) è u cuntrollu pusitivu (0,46 ± 0,02 mg/g pesu fr; Fig. 4F). In generale, sti risultati indicanu chì a L-ornitina ùn hè micca fitotossica per i legumi trattati è pò ancu stimulà a so crescita.
Fig. 4. Effettu di l'applicazione esogena di L-ornitina nantu à e caratteristiche di crescita è i pigmenti fotosintetici di e foglie di fagiolo infettate da Sclerotinia sclerotiorum in cundizioni di serra. (A) Altezza di a pianta (cm), (B) Numeru di rami per pianta, (C) Numeru di foglie per pianta, (D) Cuntenutu di clorofilla a (mg g-1 fr wt), (E) Cuntenutu di clorofilla b (mg g-1 fr wt), (F) Cuntenutu tutale di carotenoidi (mg g-1 fr wt). I valori sò a media ± SD di cinque repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicanu differenze statisticamente significative trà i trattamenti (p < 0,05).
A lucalizazione istochimica in situ di e spezie reattive di l'ossigenu (ROS; espresse cum'è perossidu d'idrogenu [H2O2]) è di i radicali liberi (espressi cum'è anioni superossidi [O2•−]) hà rivelatu chì l'applicazione esogena di L-ornitina (250 mg/L) hà riduttu significativamente l'accumulazione di H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) è O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) paragunata à l'accumulazione di e piante infettate micca trattate (173,31 ± 12,06 è 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, rispettivamente) è di e piante trattate cù 50 mg/L di u fungicida cummerciale Rizolex-T (170,12 ± 9,50 è 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, rispettivamente) à 72 h. Alti livelli di H2O2 è O2•− accumulati sottu hpt (Fig. 5A, B). In listessu modu, u test di malondialdeide (MDA) basatu annantu à TCA hà dimustratu chì e piante di fagioli infettate da S. sclerotiorum accumulanu livelli più alti di MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) in e so foglie (Fig. 5C). Tuttavia, l'applicazione esogena di L-ornitina hà riduttu significativamente a perossidazione lipidica cum'è evidenziatu da a diminuzione di u cuntenutu di MDA in e piante trattate (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effettu di l'applicazione esogena di L-ornitina nantu à i principali marcatori di stress ossidativu è meccanismi di difesa antioxidanti non enzimatici in foglie di fagioli infettate da S. sclerotiorum à 72 ore dopu l'infezione in cundizioni di serra. (A) Perossidu d'idrogenu (H2O2; nmol g−1 FW) à 72 hpt, (B) anione superossidu (O2•−; nmol g−1 FW) à 72 hpt, (C) malondialdeide (MDA; nmol g−1 FW) à 72 hpt, (D) fenoli totali solubili (mg GAE g−1 FW) à 72 hpt, (E) flavonoidi totali solubili (mg RE g−1 FW) à 72 hpt, (F) aminoacidi liberi totali (mg g−1 FW) à 72 hpt, è (G) cuntenutu di prolina (mg g−1 FW) à 72 hpt. I valori rapprisentanu a media ± deviazione standard (media ± SD) di 5 repliche biologiche (n = 5). Lettere diverse indicanu differenze statisticamente significative trà i trattamenti (p < 0,05).