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E nanoparticelle d'insulina (NP) cù un altu cuntenutu di carica anu trovu diverse applicazioni in diverse forme di dosaggio. Stu travagliu hà per scopu di valutà l'effettu di i prucessi di liofilizazione è di asciugatura à spruzzu nantu à a struttura di e nanoparticelle di chitosanu caricate d'insulina, cù o senza mannitolo cum'è crioprotettore. Avemu ancu valutatu a qualità di queste nanoparticelle ridissolvendule. Prima di a disidratazione, a dimensione di e particelle di e nanoparticelle reticolate chitosanu/tripolifosfatu di sodiu/insulina hè stata ottimizzata per esse 318 nm, u PDI era 0,18, l'efficienza di incapsulazione era 99,4% è a carica era 25,01%. Dopu a ricostituzione, tutte e nanoparticelle, eccettu quelle prodotte da un metudu di liofilizazione senza l'usu di mannitolo, anu mantenutu a so struttura sferica di particelle. Rispetto à e nanoparticelle chì cuntenenu mannitolo disidratate da spray, e nanoparticelle asciugate à spruzzu senza mannitolo anu ancu mostratu a dimensione media di e particelle più chjuca (376 nm) è u più altu cuntenutu di carica. (25,02%) cù una simile velocità d'incapsulazione (98,7%) è PDI (0,20) per via di tecniche di essiccazione o liofilizzazione. E nanoparticelle essiccate per essiccazione a spruzzo senza mannitolo anu ancu risultatu in a liberazione più rapida di insulina è a più alta efficienza di assorbimentu cellulare. Stu travagliu mostra chì l'essiccazione a spruzzo pò disidratà e nanoparticelle d'insulina senza a necessità di crioprotettori paragunatu à i metudi convenzionali di essiccazione a congelazione, creendu una maggiore capacità di carica, requisiti di additivi inferiori è un vantaghju significativu in i costi operativi.
Dapoi a so scuperta in u 19221,2,3, l'insulina è e so preparazioni farmaceutiche anu salvatu a vita di i pazienti cun diabete di tipu 1 (T1DM) è diabete di tipu 2 (T1DM). Tuttavia, per via di e so proprietà cum'è proteina à altu pesu moleculare, l'insulina hè facilmente aggregata, scumpartuta da enzimi proteolitici è eliminata da l'effettu di primu passaghju. E persone diagnosticate cun diabete di tipu 1 anu bisognu di iniezioni d'insulina per u restu di a so vita. Molti pazienti inizialmente diagnosticati cun diabete di tipu 2 anu ancu bisognu di iniezioni d'insulina à longu andà. L'iniezioni d'insulina quotidiane sò una seria fonte di dolore è disagiu quotidianu per questi individui, cù effetti negativi nantu à a salute mentale. Di cunsiguenza, altre forme di amministrazione d'insulina chì causanu menu disagiu, cum'è l'amministrazione orale d'insulina, sò state studiate ampiamente5 postu chì anu u putenziale di restaurà a qualità di vita di circa 5 miliardi di persone cun diabete in u mondu.
A tecnulugia di nanoparticelle hà furnitu un avanzamentu significativu in i tentativi di piglià insulina orale4,6,7. Una chì incapsula è prutege efficacemente l'insulina da a degradazione per una consegna mirata à siti specifici di u corpu. Tuttavia, l'usu di formulazioni di nanoparticelle hà parechje limitazioni, principalmente per via di prublemi di stabilità di e sospensioni di particelle. Una certa aggregazione pò accade durante u almacenamentu, ciò chì riduce a biodisponibilità di nanoparticelle caricate d'insulina8. Inoltre, a stabilità chimica di a matrice polimerica di nanoparticelle è insulina deve ancu esse cunsiderata per assicurà a stabilità di nanoparticelle d'insulina (NP). Attualmente, a tecnulugia di liofilizazione hè u standard d'oru per creà NP stabili mentre impedisce cambiamenti indesiderati durante u almacenamentu9.
Tuttavia, a liofilizazione richiede l'aghjunta di crioprotettori per impedisce chì a struttura sferica di e NP sia affettata da u stress meccanicu di i cristalli di ghiaccio. Questu riduce significativamente u caricamentu di nanoparticelle d'insulina dopu a liofilizazione, postu chì u crioprotettore occupa a maiò parte di u rapportu di pesu. Dunque, e NP d'insulina prodotte sò spessu inadatte per a fabricazione di formulazioni di polvere secca, cum'è compresse orali è filmi orali, per via di a necessità di grandi quantità di nanoparticelle secche per ottene a finestra terapeutica di l'insulina.
L'asciugatura à spruzzu hè un prucessu industriale ben cunnisciutu è economicu per a pruduzzione di polveri secche da fasi liquide in l'industria farmaceutica10,11. U cuntrollu di u prucessu di furmazione di particelle permette una incapsulazione curretta di parechji cumposti bioattivi12, 13. Inoltre, hè diventata una tecnica efficace per a preparazione di proteine ​​incapsulate per l'amministrazione orale. Durante l'asciugatura à spruzzu, l'acqua evapora assai rapidamente, ciò chì aiuta à mantene a temperatura di u core di e particelle bassa11,14, permettendu a so applicazione per incapsulà cumpunenti sensibili à u calore. Prima di l'asciugatura à spruzzu, u materiale di rivestimentu deve esse cumpletamente omogeneizatu cù a suluzione chì cuntene l'ingredienti incapsulati11,14. A differenza di a liofilizazione, l'omogeneizazione prima di l'incapsulazione in l'asciugatura à spruzzu migliora l'efficienza di l'incapsulazione durante a disidratazione. Siccomu u prucessu di incapsulazione per essiccazione à spruzzu ùn richiede micca crioprotettori, l'asciugatura à spruzzu pò esse aduprata per pruduce NP secche cù un altu cuntenutu di carica.
Stu studiu riporta a pruduzzione di NP caricate d'insulina per via di a reticulazione di chitosanu è tripolifosfatu di sodiu utilizendu un metudu di gel ionicu. A gelificazione ionica hè un metudu di preparazione chì permette a pruduzzione di nanoparticule per via di interazioni elettrostatiche trà duie o più spezie ioniche in certe cundizioni. E tecniche di liofilizazione è di asciugatura à spruzzu sò state aduprate per disidratà e nanoparticule reticulate di chitosanu/tripolifosfatu di sodiu/insulina ottimizzate. Dopu a disidratazione, a so morfologia hè stata analizata da SEM. A so capacità di ricombinazione hè stata valutata misurendu a so distribuzione di dimensione, a carica superficiale, u PDI, l'efficienza di incapsulazione è u cuntenutu di carica. A qualità di e nanoparticule risolubilizzate prodotte da diversi metudi di disidratazione hè stata ancu valutata paragunendu a so prutezzione di l'insulina, u cumpurtamentu di liberazione è l'efficacia di l'assorbimentu cellulare.
U pH di a suluzione mischiata è u rapportu trà chitosanu è insulina sò dui fattori chjave chì influenzanu a dimensione di e particelle è l'efficienza di incapsulazione (EE) di e NP finali, postu chì influenzanu direttamente u prucessu di gelificazione ionotropica. U pH di a suluzione mischiata hè statu dimustratu esse altamente correlatu cù a dimensione di e particelle è l'efficienza di incapsulazione (Fig. 1a). Cum'è mostratu in a Fig. 1a, quandu u pH hè aumentatu da 4,0 à 6,0, a dimensione media di e particelle (nm) hè diminuita è l'EE hè aumentatu significativamente, mentre chì quandu u pH hè aumentatu à 6,5, a dimensione media di e particelle hà cuminciatu à aumentà è l'EE hè rimasu invariatu. Quandu u rapportu trà chitosanu è insulina aumenta, a dimensione media di e particelle aumenta ancu. Inoltre, ùn hè statu osservatu alcun cambiamentu in EE quandu e nanoparticelle sò state preparate à un rapportu di massa di chitosanu/insulina superiore à 2,5:1 (p/p) (Fig. 1b). Dunque, sò state aduprate e cundizioni di preparazione ottimali in questu studiu (pH 6,0, rapportu di massa chitosanu/insulina di 2,5:1). per preparà nanoparticelle caricate d'insulina per studii ulteriori. In questa cundizione di preparazione, a dimensione media di e particelle di e nanoparticelle d'insulina hè stata ottimizzata per esse 318 nm (Fig. 1c), u PDI era 0,18, l'efficienza di embedding era 99,4%, u putenziale zeta era 9,8 mv, è a carica d'insulina era 25,01% (m/m). Basatu annantu à i risultati di a microscopia elettronica à trasmissione (TEM), e nanoparticelle ottimizzate eranu approssimativamente sferiche è discrete cù dimensioni relativamente uniformi (Fig. 1d).
Ottimizazione di i parametri di e nanoparticelle d'insulina: (a) l'effettu di u pH nantu à u diametru mediu è l'efficienza d'incapsulazione (EE) di e nanoparticelle d'insulina (preparate à un rapportu di massa di 5:1 trà chitosanu è insulina); (b) chitosanu è influenza di u rapportu di massa di l'insulina nantu à u diametru mediu è l'efficienza d'incapsulazione (EE) di e NP d'insulina (preparate à pH 6); (c) distribuzione di a dimensione di e particelle di e nanoparticelle d'insulina ottimizzate; (d) micrografia TEM di NP d'insulina ottimizzate.
Hè ben cunnisciutu chì u chitosanu hè un polielettrolitu debule cù un pKa di 6,5. Hè caricatu pusitivamente in ambienti acidi perchè u so principale gruppu aminu hè protunatu da ioni d'idrogenu15. Dunque, hè spessu adupratu cum'è vettore per incapsulà macromolecule caricate negativamente. In questu studiu, u chitosanu hè statu adupratu per incapsulà l'insulina cù un puntu isoelettricu di 5,3. Siccomu u chitosanu hè adupratu cum'è materiale di rivestimentu, cù l'aumentu di a so proporzione, u spessore di u stratu esternu di e nanoparticule aumenta currispundente, risultendu in una dimensione media di e particelle più grande. Inoltre, livelli più alti di chitosanu ponu incapsulà più insulina. In u nostru casu, l'EE era u più altu quandu u rapportu trà chitosanu è insulina hà righjuntu 2,5: 1, è ùn ci hè statu alcun cambiamentu significativu in l'EE quandu u rapportu hà cuntinuatu à cresce.
Oltre à u rapportu trà chitosanu è insulina, u pH hà ancu ghjucatu un rolu cruciale in a preparazione di NP. Gan et al. 17 anu studiatu l'effettu di u pH nantu à a dimensione di e particelle di nanoparticelle di chitosanu. Anu trovu una diminuzione cuntinua di a dimensione di e particelle finu à chì u pH hà righjuntu 6,0, è un aumentu significativu di a dimensione di e particelle hè statu osservatu à pH > 6,0, chì hè coerente cù e nostre osservazioni. Stu fenomenu hè duvutu à u fattu chì cù l'aumentu di u pH, a molecule d'insulina acquista una carica superficiale negativa, favurendu cusì l'interazioni elettrostatiche cù u cumplessu chitosanu/tripolifosfatu di sodiu (TPP), risultendu in una piccula dimensione di e particelle è un EE altu. Tuttavia, quandu u pH hè statu aghjustatu à 6,5, i gruppi aminichi nantu à u chitosanu sò stati deprotonati, risultendu in u piegamentu di u chitosanu. Cusì, un pH altu si traduce in una minore esposizione di ioni aminichi à TPP è insulina, risultendu in una reticolazione più bassa, una dimensione media finale di e particelle più grande è un EE più bassu.
L'analisi di e proprietà morfologiche di e NP liofilizzate è essiccate à spruzzu pò guidà a selezzione di migliori tecniche di disidratazione è di furmazione di polvere. U metudu preferitu deve furnisce a stabilità di a droga, una forma uniforme di e particelle, un altu caricu di droga è una bona solubilità in a suluzione originale. In questu studiu, per paragunà megliu e duie tecniche, sò state aduprate NP d'insulina cù o senza 1% di mannitolo durante a disidratazione. U mannitolo hè adupratu cum'è agente di carica o crioprotettore in varie formulazioni di polvere secca per a liofilizzazione è l'essiccazione à spruzzu. Per e nanoparticelle d'insulina liofilizzate senza mannitolo, cum'è mostratu in a Figura 2a, hè stata osservata una struttura di polvere altamente porosa cù superfici grandi, irregolari è ruvide sottu microscopia elettronica à scansione (SEM). Poche particelle discrete sò state rilevate in a polvere dopu a disidratazione (Fig. 2e). Questi risultati anu indicatu chì a maiò parte di e NP sò state decomposte durante a liofilizzazione senza alcun crioprotettore. Per e nanoparticelle d'insulina liofilizzate è essiccate à spruzzu chì cuntenenu 1% di mannitolo, sò state osservate nanoparticelle sferiche cù superfici lisce (Fig. 2b, d, f, h). E nanoparticelle d'insulina essiccate à spruzzu senza mannitolo sò rimaste sferiche ma rugose in superficia (Fig. 2c). E superfici sferiche è rugose sò discusse più in dettagliu in i testi di cumpurtamentu di liberazione è di assorbimentu cellulare quì sottu. Basatu annantu à l'aspettu visibile di e NP essiccate, sia e NP essiccate à spruzzu senza mannitolo sia e NP liofilizzate è essiccate à spruzzu cù mannitolo anu pruduttu polveri fini di NP (Fig. 2f, g, h). Più grande hè a superficia trà e superfici di e particelle, più alta hè a solubilità è dunque più alta hè a velocità di liberazione.
Morfologia di diverse nanoparticelle d'insulina disidratate: (a) Immagine SEM di nanoparticelle d'insulina liofilizzate senza mannitolo; (b) Immagine SEM di nanoparticelle d'insulina liofilizzate cù mannitolo; (c) nanoparticelle d'insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo Immagine SEM di; (d) Immagine SEM di nanoparticelle d'insulina essiccate a spruzzo cù mannitolo; (e) Immagine di polvere di nanoparticelle d'insulina liofilizzate senza mannitolo; (f) Immagine di nanoparticelle d'insulina liofilizzate cù mannitolo; (g) Immagine di polvere di nanoparticelle d'insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo; (h) Immagine di polvere di nanoparticelle d'insulina essiccate a spruzzo cù mannitolo.
Durante a liofilizazione, u mannitolu agisce cum'è un crioprotettore, mantenendu e NP in una forma amorfa è impedendu i danni da i cristalli di ghiaccio19. In cuntrastu, ùn ci hè nisuna tappa di congelazione durante a spray drying. Dunque, u mannitolu ùn hè micca necessariu in questu metudu. In fatti, e NP essiccate à spruzzu senza mannitolu anu pruduttu NP più fini cum'è descrittu prima. Tuttavia, u mannitolu pò ancu agisce cum'è un riempitore in u prucessu di spray drying per dà à e NP una struttura più sferica20 (Fig. 2d), chì aiuta à ottene un cumpurtamentu di liberazione uniforme di tali NP incapsulate. Inoltre, hè chjaru chì alcune particelle grandi ponu esse rilevate sia in NP d'insulina liofilizzate sia in quelle essiccate à spruzzu chì cuntenenu mannitolu (Fig. 2b,d), chì pò esse duvuta à l'accumulazione di mannitolu in u core di e particelle inseme cù l'insulina incapsulata. À.Stratu di chitosanu.Vale a pena nutà chì in questu studiu, per assicurà chì a struttura sferica resti intatta dopu a disidratazione, u rapportu di mannitolo è chitosanu hè mantinutu à 5: 1, affinchì una grande quantità di riempitore possa ancu ingrandà a dimensione di e particelle di e NP secche.
A spettroscopia di riflessione totale attenuata à infrarossi trasformata di Fourier (FTIR-ATR) hà caratterizatu a mistura fisica di insulina libera, chitosanu, chitosanu, TPP è insulina. Tutte e NP disidratate sò state caratterizate utilizendu a spettroscopia FTIR-ATR. In particulare, l'intensità di banda di 1641, 1543 è 1412 cm-1 sò state osservate in NP incapsulate liofilizzate cù mannitolo è in NP essiccate à spruzzo cù è senza mannitolo (Fig. 3). Cum'è riportatu prima, questi aumenti di forza eranu assuciati à u cross-linking trà chitosanu, TPP è insulina. L'indagine di l'interazione trà chitosanu è insulina hà dimustratu chì in i spettri FTIR di nanoparticelle di chitosanu caricate d'insulina, a banda di chitosanu si sovrappone à quella di l'insulina, aumentendu l'intensità carbonilica (1641 cm-1) è a cintura amina (1543 cm-1). I gruppi tripolifosfati di TPP sò ligati à i gruppi ammonici in chitosanu, furmendu una banda à 1412 cm-1.
Spettri FTIR-ATR di insulina libera, chitosanu, miscele fisiche di chitosanu/TPP/insulina è NP disidratate cù diversi metudi.
Inoltre, questi risultati sò coerenti cù quelli mostrati in SEM, chì anu dimustratu chì e NP incapsulate sò rimaste intatte sia quandu sò state spruzzate sia liofilizzate cù mannitolo, ma in assenza di mannitolo, solu l'asciugatura à spruzzo hà pruduttu particelle incapsulate. In cuntrastu, i risultati spettrali FTIR-ATR di NP liofilizzate senza mannitolo eranu assai simili à a mistura fisica di chitosanu, TPP è insulina. Questu risultatu indica chì i ligami incrociati trà chitosanu, TPP è insulina ùn sò più presenti in NP liofilizzate senza mannitolo. A struttura di e NP hè stata distrutta durante a liofilizzazione senza crioprotettore, chì pò esse vistu in i risultati SEM (Fig. 2a). Basatu annantu à a morfologia è i risultati FTIR di NP d'insulina disidratate, solu NP liofilizzate, liofilizzate è senza mannitolo sò state aduprate per esperimenti di ricostituzione è NP senza mannitolo per via di a decomposizione di NP senza mannitolo durante a disidratazione. discute.
A disidratazione hè aduprata per u almacenamentu à longu andà è u riprocessamentu in altre formulazioni. A capacità di e NP secche di ricostituisce dopu u almacenamentu hè critica per u so usu in diverse formulazioni cum'è tablette è filmi. Avemu nutatu chì a dimensione media di e particelle di e NP d'insulina essiccate à spruzzu in assenza di mannitolo hè aumentata solu ligeramente dopu a ricostituzione. D’altronde, a dimensione di e particelle di e nanoparticelle d'insulina essiccate à spruzzu è liofilizzate cù mannitolo hè aumentata significativamente (Tabella 1). PDI è EE ùn sò micca stati cambiati significativamente (p > 0,05) dopu a ricombinazione di tutte e NP in questu studiu (Tabella 1). Questu risultatu indica chì a maiò parte di e particelle sò rimaste intatte dopu a ridissoluzione. Tuttavia, l'aggiunta di mannitolo hà risultatu in una carica d'insulina assai ridutta di nanoparticelle di mannitolo liofilizzate è essiccate à spruzzu (Tabella 1). In cuntrastu, u cuntenutu di carica d'insulina di e NP essiccate à spruzzu senza mannitolo hè rimasu u listessu cum'è prima (Tabella 1).
Hè ben cunnisciutu chì u caricamentu di nanoparticule hè criticu quandu hè adupratu per scopi di consegna di farmaci. Per e NP cù carichi bassi, sò necessarie quantità assai grande di materiale per ghjunghje à a soglia terapeutica. Tuttavia, l'alta viscosità di tali alte concentrazioni di NP porta à inconvenienti è difficultà in l'amministrazione orale è in e formulazioni iniettabili, rispettivamente 22. Inoltre, e NP d'insulina ponu ancu esse aduprate per fà tablette è biofilm viscosi 23, 24, ciò chì richiede l'usu di grandi quantità di NP à bassi livelli di carica, risultendu in tablette grandi è biofilm spessi chì ùn sò micca adatti per applicazioni orali. Dunque, e NP disidratate cù un altu caricamentu d'insulina sò assai desiderabili. I nostri risultati suggerenu chì l'altu caricamentu d'insulina di e NP essiccate à spray senza mannitolo pò offre parechji vantaghji attraenti per questi metudi di consegna alternativi.
Tutte e NP disidratate sò state tenute in frigorifero per trè mesi. I risultati di u SEM anu dimustratu chì a morfologia di tutte e NP disidratate ùn hè micca cambiata significativamente durante a conservazione di trè mesi (Fig. 4). Dopu a ricostituzione in acqua, tutte e NP anu dimustratu una ligera diminuzione di l'EE è anu liberatu circa una piccula quantità (~ 5%) d'insulina durante u periodu di conservazione di trè mesi (Tabella 2). Tuttavia, a dimensione media di e particelle di tutte e nanoparticelle hè aumentata. A dimensione di e particelle di e NP essiccate à spruzzu senza mannitolo hè aumentata à 525 nm, mentre quella di e NP essiccate à spruzzu è liofilizzate cù mannitolo hè aumentata à 872 è 921 nm, rispettivamente (Tabella 2).
Morfologia di diverse nanoparticelle d'insulina disidratate conservate per trè mesi: (a) Immagine SEM di nanoparticelle d'insulina liofilizzate cù mannitolo; (b) Immagine SEM di nanoparticelle d'insulina essiccate a spruzzo senza mannitolo; (c) senza mannitolo Immagini SEM di nanoparticelle d'insulina essiccate a spruzzo.
Inoltre, sò stati osservati precipitati in e nanoparticelle d'insulina ricostituite, asciugate à spruzzu cù mannitolo è liofilizzate (Fig. S2). Questu pò esse causatu da particelle grosse chì ùn sò micca sospese currettamente in l'acqua. Tutti i risultati sopra indicati dimustranu chì a tecnica di asciugatura à spruzzu pò prutege e nanoparticelle d'insulina da a disidratazione è chì si ponu ottene carichi elevati di nanoparticelle d'insulina senza alcun riempitivo o crioprotettore.
A ritenzione di l'insulina hè stata testata in un mediu di pH = 2,5 cù pepsina, tripsina è α-chimotripsina per dimustrà a capacità protettiva di e NP contr'à a digestione enzimatica dopu a disidratazione. A ritenzione di l'insulina di e NP disidratate hè stata paragunata cù quella di e NP appena preparate, è l'insulina libera hè stata aduprata cum'è cuntrollu negativu. In questu studiu, l'insulina libera hà mostratu una rapida eliminazione di l'insulina in 4 ore in tutti i trè trattamenti enzimatici (Fig. 5a-c). In cuntrastu, i testi di eliminazione di l'insulina di e NP liofilizzate cù mannitolo è di e NP spray-secche cù o senza mannitolo anu mostratu una prutezzione significativamente più alta di queste NP contr'à a digestione enzimatica, chì era simile à quella di e NP di insulina appena preparate (figura 1).5a-c). Cù l'aiutu di nanoparticelle in pepsina, tripsina è α-chimotripsina, più di u 50%, 60% è 75% di l'insulina puderia esse prutetta in 4 ore, rispettivamente (Fig. 5a-c). Questa prutezzione di l'insulina A capacità pò aumentà a probabilità di una maggiore assorbimentu di l'insulina in u sangue25. Questi risultati suggerenu chì l'asciugatura à spruzzo cù o senza mannitolo è a liofilizzazione cù mannitolo ponu priservà a capacità protettiva di l'insulina di e NP dopu a disidratazione.
Prutezzione è cumpurtamentu di liberazione di nanoparticule d'insulina disidratate: (a) prutezzione di l'insulina in soluzione di pepsina; (b) prutezzione di l'insulina in soluzione di tripsina; (c) prutezzione di l'insulina da soluzione di α-chimotripsina; (d) U cumpurtamentu di liberazione di nanoparticule disidratate in soluzione di pH = 2,5; (e) u cumpurtamentu di liberazione di nanoparticule disidratate in soluzione di pH = 6,6; (f) u cumpurtamentu di liberazione di nanoparticule disidratate in soluzione di pH = 7,0.
NP d'insulina secca appena preparate è ricostituite sò state incubate in diversi buffer (pH = 2,5, 6,6, 7,0) à 37 °C, simulendu l'ambiente di pH di u stomacu, di u duodenu è di a parte superiore di l'intestinu tenue, per esaminà l'effettu di l'insulina nantu à a resistenza à l'insulina. Cumportamentu di liberazione in diversi ambienti. Frammentu di u trattu gastrointestinale. À pH = 2,5, e NP caricate d'insulina è e NP d'insulina secca risolubilizzate anu mostratu una liberazione iniziale à scoppiu in a prima ora, seguita da una liberazione lenta in e prossime 5 ore (Fig. 5d). Questa liberazione rapida à l'iniziu hè assai prubabilmente u risultatu di una rapida desorbzione superficiale di molecule proteiche chì ùn sò micca cumpletamente immobilizzate in a struttura interna di a particella. À pH = 6,5, e NP caricate d'insulina è e NP d'insulina secca ricostituite anu mostratu una liberazione liscia è lenta in 6 ore, postu chì u pH di a soluzione di prova era simile à quellu di a soluzione preparata da NP (Fig. 5e). À pH = 7, e NP eranu instabili è si sò decomposte quasi cumpletamente in e prime duie ore (Fig. 5f). Questu hè perchè a deprotonazione di u chitosanu si verifica à pH più altu, ciò chì si traduce in una rete polimerica menu compacta è in a liberazione di insulina caricata.
Inoltre, e nanoparticelle d'insulina essiccate à spruzzu senza mannitolo anu mostratu un prufilu di liberazione più veloce cà l'altre nanoparticelle disidratate (Fig. 5d-f). Cum'è descrittu prima, e nanoparticelle d'insulina ricostituite essiccate senza mannitolo anu mostratu a dimensione di particelle più chjuca. E piccule particelle furniscenu una superficia più grande, dunque a maiò parte di a droga pertinente serà à o vicinu à a superficia di a particella, risultendu in una liberazione rapida di a droga26.
A citotossicità di e NP hè stata investigata per mezu di u test MTT. Cum'è mostratu in a Figura S4, tutte e NP disidratate ùn anu micca effettu significativu nantu à a viabilità cellulare à concentrazioni di 50-500 μg/ml, ciò chì suggerisce chì tutte e NP disidratate ponu esse aduprate in modu sicuru per ghjunghje à a finestra terapeutica.
U fegatu hè l'organu principale per mezu di u quale l'insulina esercita e so funzioni fisiologiche. E cellule HepG2 sò una linea cellulare di epatoma umanu cumunemente aduprata cum'è mudellu di assorbimentu di epatociti in vitro. Quì, e cellule HepG2 sò state aduprate per valutà l'assorbimentu cellulare di NP disidratate aduprendu metudi di liofilizazione è di asciugatura à spruzzu. Assorbimentu cellulare per scansione laser cunfocale aduprendu citometria di flussu è visione dopu à parechje ore di incubazione cù insulina FITC libera à una cuncentrazione di 25 μg/mL, NP caricate d'insulina FITC appena preparate è NP caricate d'insulina FITC disidratate à uguali concentrazioni d'insulina. Sò state realizate osservazioni di microscopia quantitativa (CLSM). E NP liofilizzate senza mannitolo sò state distrutte durante a disidratazione è ùn sò state valutate in questu test. L'intensità di fluorescenza intracellulare di NP caricate d'insulina appena preparate, NP liofilizzate cù mannitolo è NP essiccate à spruzzu cù è senza mannitolo (Fig. 6a) eranu 4,3, 2,6, 2,4, è 4,1 volte più alti di quelli liberi. Gruppu FITC-insulina, rispettivamente (Fig. 6b). Questi risultati suggerenu chì l'insulina incapsulata hè più putente in l'assorbimentu cellulare chè l'insulina libera, principalmente per via di a dimensione più chjuca di e nanoparticelle caricate d'insulina prodotte in u studiu.
Assorbimentu di e cellule HepG2 dopu à 4 ore d'incubazione cù NP appena preparate è NP disidratate: (a) Distribuzione di l'assorbimentu di l'insulina FITC da e cellule HepG2. (b) Media geometrica di l'intensità di fluorescenza analizzate per citometria di flussu (n = 3), *P < 0,05 paragunatu à l'insulina libera.
In listessu modu, l'imagine CLSM anu dimustratu chì l'intensità di fluorescenza FITC di NP caricate d'insulina FITC appena preparate è NP essiccate à spruzzu caricate d'insulina FITC (senza mannitolo) eranu assai più forti di quelle di l'altri campioni (Fig. 6a). Inoltre, cù l'aghjunta di mannitolo, a più alta viscosità di a suluzione hà aumentatu a resistenza à l'assorbimentu cellulare, risultendu in una diminuzione di a proliferazione di l'insulina. Questi risultati suggerenu chì e NP essiccate à spruzzu senza mannitolo anu mostratu a più alta efficienza di assorbimentu cellulare perchè a so dimensione di particelle era più chjuca di quella di e NP liofilizzate dopu a ri-dissoluzione.
U chitosanu (pesu moleculare mediu 100 KDa, 75-85% deacetilatu) hè statu acquistatu da Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). U tripolifosfatu di sodiu (TPP) hè statu acquistatu da VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). L'insulina umana ricombinante aduprata in questu studiu era da Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). L'insulina umana marcata cù isotiocianatu di fluoresceina (FITC) è u dicloridrato di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) sò stati acquistati da Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). A linea cellulare HepG2 hè stata ottenuta da ATCC (Manassas, Virginia, USA). Tutti l'altri reagenti eranu di qualità analitica o cromatografica.
Preparate una suluzione CS di 1 mg/ml dissolvendula in acqua bidistillata (acqua DD) chì cuntene 0,1% d'acidu aceticu. Preparate suluzioni di 1 mg/ml di TPP è insulina dissolvenduli rispettivamente in acqua DD è 0,1% d'acidu aceticu. A pre-emulsione hè stata preparata cù un omogeneizzatore d'alta velocità polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). U prucessu di preparazione hè u seguente: prima, 2 ml di suluzione TPP sò aghjunti à 4 ml di suluzione d'insulina, è a mistura hè agitata per 30 minuti è cumpletamente mischiata. Dopu, a suluzione mischiata hè stata aghjunta goccia à goccia à a suluzione CS per mezu di una siringa sottu agitazione à alta velocità (10.000 rpm). E miscele sò state tenute sottu agitazione à alta velocità (15.000 rpm) in un bagnu di ghiaccio per 30 minuti, è sò state aghjustate à un certu pH per ottene NP d'insulina reticolate. Per omogeneizà ulteriormente è riduce a dimensione di e particelle di NP d'insulina, sò state sonicate per 30 minuti supplementari in un bagnu di ghiaccio cù un sonicatore di tipu sonda (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germania).
L'NSP d'insulina sò stati testati per u diametru mediu Z, l'indice di polidispersità (PDI) è u putenziale zeta utilizendu misurazioni di scattering dinamicu di luce (DLS) utilizendu un Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) diluenduli in acqua DD à 25°C. A morfologia è a distribuzione di e dimensioni sò state carattarizate da un microscopiu elettronicu à trasmissione (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Giappone), è l'imaghjini sò state successivamente analizzate utilizendu u software d'imaghjini Hitachi (Hitachi, Tokyo, Giappone). Per valutà l'efficienza di incapsulazione (EE) è a capacità di carica (LC) di e NP d'insulina, e NP sò state pipettate in tubi di ultrafiltrazione cù un limite di pesu moleculare di 100 kDa è centrifugate à 500 xg per 30 min. L'insulina non incapsulata in u filtratu hè stata quantificata utilizendu un sistema HPLC Agilent Serie 1100 (Agilent, Santa Clara, California, USA) custituitu da una pompa quaternaria, un autocampionatore, un riscaldatore di colonna, è un rilevatore DAD. L'insulina hè stata analizata da una colonna C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) è rilevata à 214 nm. A fase mobile era acetonitrile è acqua, chì cuntene 0,1% TFA, rapporti di gradiente da 10/90 à 100/0, è hè stata eseguita per 10 minuti. A fase mobile hè stata pompata à una velocità di flussu di 1,0 ml/min. A temperatura di a colonna hè stata impostata à 20 °C. Calculate e percentuali di EE è LC aduprendu l'equazioni (1) è l'Eq. (2).
Diversi rapporti CS/insulina chì varianu da 2,0 à 4,0 sò stati testati per ottimizà l'insulina NP. Diverse quantità di soluzione CS sò state aghjunte durante a preparazione, mentre a mistura insulina/TPP hè stata mantenuta costante. L'insulina NP hè stata preparata in l'intervallu di pH da 4,0 à 6,5 cuntrullendu attentamente u pH di a mistura dopu avè aghjuntu tutte e soluzioni (insulina, TPP è CS). L'EE è a dimensione di e particelle di e nanoparticelle d'insulina sò state valutate à diversi valori di pH è rapporti di massa CS/insulina per ottimizà a furmazione di insulina NP.
I nanoparticelle d'insulina ottimizzate sò state piazzate nantu à u cuntinente d'aluminiu è cuperte cù un tissutu strettu cù un pocu di nastro adesivo. In seguitu, i cuntinenti avvitati sò stati piazzati in un liofilizzatore Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) equipatu cù un essiccatore à vassoi. A temperatura è a pressione di u vacuum sò state impostate à -10 °C, 0,350 Torr per e prime 2 ore, è 0 °C è 0,120 Torr per e restanti 22 ore di e 24 ore per ottene nanoparticelle d'insulina secche.
L'asciugatore a spruzzo Buchi Mini B-290 (BÜCHI, Flawil, Svizzera) hè statu utilizatu per generà insulina incapsulata. I parametri di asciugatura selezziunati eranu: temperatura 100 °C, flussu di alimentazione 3 L/min è flussu di gas 4 L/min.
E nanoparticule d'insulina prima è dopu a disidratazione sò state carattarizate cù a spettroscopia FTIR-ATR. E nanoparticule disidratate, è ancu l'insulina libera è u chitosanu, sò state analizate cù un spettrofotometru FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) equipatu cù un accessorio universale di campionamentu ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). E medie di u signale sò state ottenute da 16 scansioni à una risoluzione di 4 cm2 in a gamma di frequenza di 4000-600 cm2.
A morfologia di e nanoparticule d'insulina secche hè stata valutata da immagini SEM di nanoparticule d'insulina liofilizzate è essiccate à spruzzu catturate da un microscopiu elettronicu à scansione di fasciu di ioni focalizatu Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). U parametru principale utilizatu era a tensione di 5 keV è a corrente di 30 mA.
Tutte e nanoparticule d'insulina disidratate sò state ridissolte in acqua dd. A dimensione di e particelle, PDI, EE è LC sò state testate di novu aduprendu u listessu metudu citatu prima per valutà a so qualità dopu a disidratazione. A stabilità di e nanoparticule d'anidroinsulina hè stata ancu misurata testendu e proprietà di e nanoparticule dopu una conservazione prolungata. In questu studiu, tutte e nanoparticule dopu a disidratazione sò state conservate in frigorifero per trè mesi. Dopu à trè mesi di conservazione, e nanoparticule sò state testate per a dimensione morfologica di e particelle, PDI, EE è LC.
Dissolve 5 mL di NP ricostituite in 45 mL chì cuntene fluidu gastricu simulatu (pH 1,2, chì cuntene 1% di pepsina), fluidu intestinale (pH 6,8, chì cuntene 1% di tripsina) o soluzione di chimotripsina (100 g/mL, in tampone fosfatu, pH 7,8) per valutà l'efficacia di l'insulina in a prutezzione di e NP dopu a disidratazione. Sò state incubate à 37°C cù una velocità di agitazione di 100 rpm. 500 μL di a soluzione sò stati raccolti in diversi momenti è a concentrazione di insulina hè stata determinata da HPLC.
U cumpurtamentu di liberazione in vitro di nanoparticule d'insulina appena preparate è disidratate hè statu testatu cù u metudu di a sacca di dialisi (limitu di pesu moleculare 100 kDa, Spectra Por Inc.). E nanoparticule secche appena preparate è ricostituite sò state dializzate in fluidi à pH 2,5, pH 6,6 è pH 7,0 (soluzione salina tamponata cù fosfatu 0,1 M, PBS) per simulà l'ambiente di pH di u stomacu, di u duodenu è di a parte superiore di l'intestinu tenue, rispettivamente. Tutti i campioni sò stati incubati à 37 °C cù agitazione cuntinua à 200 rpm. Aspirate u fluidu fora di a sacca di dialisi di 5 mL à i seguenti tempi: 0,5, 1, 2, 3, 4 è 6 ore, è riempite immediatamente u vulume cù dializzatu frescu. A contaminazione da insulina in u fluidu hè stata analizzata da HPLC, è a velocità di liberazione di insulina da e nanoparticule hè stata calculata da u rapportu trà insulina libera è insulina totale incapsulata in e nanoparticule (Equazione 3).
E cellule di a linea cellulare di carcinoma epatocellulare umanu HepG2 sò state cultivate in piastre di 60 mm di diametru utilizendu u Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) chì cuntene 10% di serum bovinu fetale, 100 UI/mL di penicillina è 100 μg/mL di streptomicina29. E culture sò state mantenute à 37°C, 95% di umidità relativa è 5% di CO2. Per i saggi di assorbimentu, e cellule HepG2 sò state seminate à 1 × 105 cellule/ml nantu à un sistema di vetri a camera Nunc Lab-Tek à 8 pozzetti (Thermo Fisher, NY, USA). Per i saggi di citotossicità, sò state seminate in piastre à 96 pozzetti (Corning, NY, USA) à una densità di 5 × 104 cellule/ml.
U test MTT hè statu utilizatu per valutà a citotossicità di NP d'insulina appena preparate è disidratate30. E cellule HepG2 sò state seminate in piastre à 96 pozzetti à una densità di 5 × 104 cellule/mL è cultivate per 7 ghjorni prima di u test. E NP d'insulina sò state diluite à varie concentrazioni (da 50 à 500 μg/mL) in un mezu di cultura è poi amministrate à e cellule. Dopu à 24 ore d'incubazione, e cellule sò state lavate 3 volte cù PBS è incubate cù un mezu chì cuntene 0,5 mg/ml di MTT per altre 4 ore. A citotossicità hè stata valutata misurendu a riduzione enzimatica di MTT di tetrazolium giallu à formazan viola à 570 nm utilizendu un lettore di piastre spettrofotometru Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Svizzera).
L'efficienza di l'assorbimentu cellulare di e NP hè stata testata per microscopia cunfocale à scansione laser è analisi di citometria di flussu. Ogni pozzu di u sistema di vetri di camera Nunc Lab-Tek hè statu trattatu cù insulina FITC libera, NP caricate cù insulina FITC, è ricostituitu 25 μg/mL di NP di insulina FITC disidratata à a stessa concentrazione è incubatu per 4 ore. E cellule sò state lavate 3 volte cù PBS è fissate cù 4% di paraformaldeide. I nuclei sò stati colorati cù 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). A lucalizazione di l'insulina hè stata osservata utilizendu un microscopiu cunfocale à scansione laser/dui fotoni Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Giappone). Per l'analisi di citometria di flussu, sò state aghjunte e stesse concentrazioni di 10 μg/mL di insulina FITC libera, NP caricate cù insulina FITC è NP di insulina FITC disidratata risolubilizzate. Piastre à 96 pozzetti seminate cù cellule HepG2 è incubate per 4 ore. Dopu à 4 ore d'incubazione, e cellule sò state rimosse è lavate 3 volte cù FBS. 5 × 104 cellule per campione sò state analizate da un citometru di flussu BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Stati Uniti).
Tutti i valori sò espressi cum'è media ± deviazione standard. I paragoni trà tutti i gruppi sò stati valutati cù ANOVA à una via o t-test da IBM SPSS Statistics 26 per Mac (IBM, Endicott, New York, USA) è p < 0,05 hè statu cunsideratu statisticamente significativu.
Stu studiu dimostra a flessibilità è a capacità di l'asciugatura à spruzzu per disidratà e nanoparticelle di chitosanu/TPP/insulina reticolate cù una migliore ricostituzione paragunata à i metudi standard di liofilizazione chì utilizanu agenti di carica o capacità crioprotettori è una maggiore capacità di carica. E nanoparticelle d'insulina ottimizzate anu pruduttu una dimensione media di e particelle di 318 nm è una efficienza di incapsulazione di 99,4%. I risultati SEM è FTIR dopu a disidratazione anu dimustratu chì a struttura sferica hè stata mantenuta solu in NP essiccate à spruzzu cù è senza mannitolo è liofilizzate cù mannitolo, ma e NP liofilizzate senza mannitolo sò state decomposte durante a disidratazione. In u test di capacità di ricostituzione, e nanoparticelle d'insulina essiccate à spruzzu senza mannitolo anu dimustratu a dimensione media di e particelle più chjuca è u caricamentu più altu dopu a ricostituzione. I cumpurtamenti di liberazione di tutte queste NP disidratate anu dimustratu chì sò state liberate rapidamente in soluzioni di pH = 2,5 è pH = 7, è assai stabili in soluzione di pH = 6,5. Paragunate à altre NP disidratate ridissolte, e NP L'essiccazione à spruzzu senza mannitolo hà mostratu a liberazione più rapida. Stu risultatu hè coerente cù quellu osservatu in u test di assorbimentu cellulare, postu chì e NP essiccate à spruzzu in assenza di mannitolo anu mantenutu quasi cumpletamente l'efficienza di assorbimentu cellulare di e NP appena preparate. Quessi risultati suggerenu chì e nanoparticelle d'insulina secche preparate per essiccazione à spruzzu senza mannitolo sò più adatte per un'ulteriore trasfurmazione in altre forme di dosaggio anidre, cum'è compresse orali o film bioadesivi.
A causa di prublemi di pruprietà intellettuale, i datasets generati è/o analizzati durante u studiu attuale ùn sò micca dispunibili publicamente, ma sò dispunibili da i rispettivi autori nantu à dumanda ragionevule.
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