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L'acidu propionicu (PPA) hè adupratu per studià u rolu di a disfunzione mitocondriale in i disordini di u neurosviluppu cum'è u disordine di u spettru autisticu. U PPA hè cunnisciutu per interrompe a biogenesi, u metabolismu è u turnover mitocondriale. Tuttavia, l'effetti di u PPA nantu à a dinamica mitocondriale, a fissione è a fusione restanu problematichi per via di a natura temporale cumplessa di sti meccanismi. Quì, usemu tecniche d'imaghjini quantitative cumplementari per investigà cumu u PPA affetta l'ultrastruttura, a morfologia è a dinamica mitocondriale in e cellule SH-SY5Y simili à i neuroni. U PPA (5 mM) hà causatu una diminuzione significativa di l'area mitocondriale (p < 0,01), u diametru è a circunferenza di Feret (p < 0,05), è l'area 2 (p < 0,01). L'analisi di u localizatore di eventi mitocondriali hà mostratu un aumentu significativu (p < 0,05) di l'eventi di fissione è fusione, mantenendu cusì l'integrità di a rete mitocondriale in cundizioni di stress. Inoltre, l'espressione di l'mRNA di cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) è OPA1 (p < 0,05) hè stata significativamente ridutta. 01). Questu illustra u rimodellamentu di a morfologia mitocondriale, a biogenesi è a dinamica per mantene a funzione in cundizioni di stress. I nostri dati furniscenu una nova visione di l'effetti di u PPA nantu à a dinamica mitocondriale è mettenu in risaltu l'utilità di e tecniche d'imaghjini per studià i meccanismi regulatori cumplessi implicati in e risposte à u stress mitocondriale.
I mitocondri sò participanti integrali in una varietà di funzioni cellulari al di là di i so roli tipici in a pruduzzione d'energia è a biosintesi. U metabolismu mitocondriale hè un regulatore chjave di a segnalazione di u calciu, l'omeostasi metabolica è redox, a segnalazione infiammatoria, e mudificazioni epigenetiche, a proliferazione cellulare, a differenziazione è a morte cellulare prugrammata1. In particulare, u metabolismu mitocondriale hè criticu per u sviluppu neuronale, a sopravvivenza è a funzione è hè largamente implicatu in varie manifestazioni di neuropatologia2,3,4.
In l'ultima dicina d'anni, u statu metabolicu hè diventatu un regulatore cintrali di a neurogenesi, a differenziazione, a maturazione è a plasticità5,6. Recentemente, a morfologia è a dinamica mitocondriale sò diventate cumpunenti particularmente impurtanti di a mitosi, un prucessu dinamicu chì mantene un gruppu di mitocondri sani in e cellule. A dinamica mitocondriale hè regulata da percorsi interdipendenti cumplessi chì vanu da a biogenesi mitocondriale è a bioenergetica à a fissione, a fusione, u trasportu è a clearance mitocondriale7,8. L'interruzzione di qualsiasi di sti meccanismi integrativi impedisce u mantenimentu di e rete mitocondriali sane è hà cunsequenze funziunali prufonde per u neurosviluppu9,10. In effetti, a disregulazione di a dinamica mitocondriale hè osservata in parechji disordini psichiatrici, neurodegenerativi è di u neurosviluppu, cumpresi i disordini di u spettru autisticu (ASD)11,12.
L'ASD hè un disordine neurodevelopmentale eterogeneu cù una architettura genetica è epigenetica cumplessa. L'ereditabilità di l'ASD hè indiscussa, ma l'etiologia moleculare sottostante ferma pocu capita. L'accumulazione di dati da mudelli preclinichi, studii clinichi è insemi di dati moleculari multi-omici furnisce evidenze crescenti di disfunzione mitocondriale in l'ASD13,14. Avemu prima realizatu un screening di metilazione di u DNA à livellu di genomu in una coorte di pazienti cun ASD è avemu identificatu geni metilati differenzialmente raggruppati longu e vie metaboliche mitocondriali15. Dopu avemu riportatu a metilazione differenziale di i regulatori centrali di a biogenesi è di a dinamica mitocondriale, chì era assuciata à un aumentu di u numeru di copie di mtDNA è à un prufilu metabolicu urinariu alteratu in l'ASD16. I nostri dati furniscenu evidenze crescenti chì a dinamica mitocondriale è l'omeostasi ghjocanu un rolu centrale in a fisiopatologia di l'ASD. Dunque, migliurà a comprensione meccanistica di a relazione trà a dinamica mitocondriale, a morfologia è a funzione hè un scopu chjave di a ricerca in corsu nantu à e malatie neurologiche carattarizate da disfunzione mitocondriale secundaria.
E tecniche moleculari sò spessu aduprate per studià u rolu di geni specifichi in e risposte à u stress mitocondriale. Tuttavia, questu approcciu pò esse limitatu da a natura multiforme è temporale di i meccanismi di cuntrollu mitoticu. Inoltre, l'espressione differenziale di i geni mitocondriali hè un indicatore indirettu di cambiamenti funziunali, soprattuttu perchè solu un numeru limitatu di geni sò tipicamente analizati. Dunque, sò stati pruposti metudi più diretti per studià a funzione mitocondriale è a bioenergetica17. A morfologia mitocondriale hè strettamente ligata à a dinamica mitocondriale. A forma, a connettività è a struttura mitocondriale sò critiche per a pruduzzione di energia è a sopravvivenza mitocondriale è cellulare5,18. Inoltre, i vari cumpunenti di a mitosi si focalizanu nantu à i cambiamenti in a morfologia mitocondriale, chì ponu serve cum'è endpoint utili di a disfunzione mitocondriale è furnisce una basa per studii meccanismichi successivi.
A morfologia mitocondriale pò esse osservata direttamente cù a microscopia elettronica à trasmissione (TEM), chì permette un studiu dettagliatu di l'ultrastruttura cellulare. U TEM visualiza direttamente a morfologia, a forma è a struttura di e creste mitocondriali à a risoluzione di i mitocondri individuali, invece di affidà si solu à a trascrizione genica, l'espressione proteica o i parametri funziunali mitocondriali in e pupulazioni cellulari17,19,20. Inoltre, u TEM facilita u studiu di l'interazioni trà i mitocondri è altri organelli, cum'è u reticulum endoplasmicu è l'autofagosomi, chì ghjocanu roli chjave in a funzione mitocondriale è l'omeostasi21,22. Cusì, questu face di u TEM un bon puntu di partenza per studià a disfunzione mitocondriale prima di fucalizza si nantu à vie o geni specifici. Cù a funzione mitocondriale chì diventa sempre più pertinente per a neuropatologia, ci hè un bisognu chjaru di pudè studià direttamente è quantitativamente a morfologia è a dinamica mitocondriale in mudelli neuronali in vitro.
In questu articulu, esaminemu a dinamica mitocondriale in un mudellu neuronale di disfunzione mitocondriale in u disordine di u spettru autisticu. Avemu digià signalatu a metilazione differenziale di a propionil-CoA carbossilasi beta (PCCB) in ASD15, una subunità di l'enzima propionil-CoA carbossilasi mitocondriale PCC. A disregulazione di PCC hè cunnisciuta per causà accumulazione tossica di derivati ​​propionilici, cumpresu l'acidu propionicu (PPA)23,24,25. Hè statu dimustratu chì u PPA perturba u metabolismu neuronale è altera u cumpurtamentu in vivo è hè un mudellu animale stabilitu per studià i meccanismi di neurosviluppu implicati in ASD26,27,28. Inoltre, hè statu signalatu chì u PPA perturba u putenziale di a membrana mitocondriale, a biogenesi è a respirazione in vitro è hè statu largamente utilizatu per mudellà a disfunzione mitocondriale in i neuroni29,30. Tuttavia, l'impattu di a disfunzione mitocondriale indotta da PPA nantu à a morfologia è a dinamica mitocondriale ferma pocu capitu.
Stu studiu usa tecniche d'imaghjini cumplementari per quantificà l'effetti di u PPA nantu à a morfologia, a dinamica è a funzione mitocondriale in e cellule SH-SY5Y. Prima, avemu sviluppatu un metudu TEM per visualizà i cambiamenti in a morfologia è l'ultrastruttura mitocondriale17,31,32. Data a natura dinamica di i mitocondri33, avemu ancu utilizatu l'analisi di u localizatore di eventi mitocondriali (MEL) per quantificà i cambiamenti in l'equilibriu trà l'eventi di fissione è fusione, u numeru è u vulume mitocondriali sottu à u stress PPA. Infine, avemu esaminatu se a morfologia è a dinamica mitocondriale sò assuciate à cambiamenti in l'espressione di i geni implicati in a biogenesi, a fissione è a fusione. Pigliati inseme, i nostri dati illustranu a sfida di elucidà a cumplessità di i meccanismi chì regulanu a dinamica mitocondriale. Evidenziemu l'utilità di u TEM in u studiu di a morfologia mitocondriale cum'è un endpoint convergente misurabile di a mitosi in e cellule SH-SY5Y. Inoltre, evidenziemu chì i dati TEM furniscenu l'infurmazioni più ricche quandu sò cumminati cù tecniche d'imaghjini chì catturanu ancu eventi dinamici in risposta à u stress metabolicu. Una caratterizazione più approfondita di i meccanismi regulatori moleculari chì sustenenu a mitosi di e cellule neuronali pò furnisce una visione impurtante di a cumpunente mitocondriale di u sistema nervosu è di e malatie neurodegenerative.
Per induce u stress mitocondriale, e cellule SH-SY5Y sò state trattate cù PPA aduprendu 3 mM è 5 mM di propionatu di sodiu (NaP). Prima di u TEM, i campioni sò stati sottumessi à preparazione criogenica di campioni aduprendu congelazione à alta pressione è congelazione (Fig. 1a). Avemu sviluppatu una pipeline automatizata d'analisi d'imagine mitocondriale per misurà ottu parametri morfologichi di e pupulazioni mitocondriali in trè repliche biologiche. Avemu trovu chì u trattamentu PPA hà cambiatu significativamente quattru parametri: area 2, area, perimetru è diametru di Feret (Fig. 1b-e). L'area 2 hè diminuita significativamente cù u trattamentu PPA 3 mM è 5 mM (p = 0,0183 è p = 0,002, rispettivamente) (Fig. 1b), mentre chì l'area (p = 0,003), u perimetru (p = 0,0106) è u diametru di Feret sò tutti diminuiti significativamente. Ci hè stata una riduzione significativa (p = 0,0172) in u gruppu di trattamentu 5 mM paragunatu à u gruppu di cuntrollu (Fig. 1c-e). Riduzioni significative di l'area è di a circunferenza anu dimustratu chì e cellule trattate cù 5 mM di PPA avianu mitocondri più chjuchi è più arrotondati, è chì questi mitocondri eranu menu allungati di quelli di e cellule di cuntrollu. Questu hè ancu coerente cù una diminuzione significativa di u diametru di Feret, un parametru indipendente chì indica una diminuzione di a più grande distanza trà i bordi di e particelle. Sò stati osservati cambiamenti in l'ultrastruttura di e creste: e creste sò diventate menu pronunciate sottu l'influenza di u stress PPA (Fig. 1a, pannellu B). Tuttavia, micca tutte l'imagine anu riflessu chjaramente l'ultrastruttura di e creste, dunque ùn hè stata realizata un'analisi quantitativa di questi cambiamenti. Questi dati TEM ponu riflette trè scenarii pussibuli: (1) u PPA aumenta a fissione o inibisce a fusione, causendu a riduzione di e dimensioni di i mitocondri esistenti; (2) una biogenesi migliorata crea novi mitocondri più chjuchi o (3) induce entrambi i meccanismi simultaneamente. Ancu se queste cundizioni ùn ponu esse distinte da TEM, cambiamenti morfologichi significativi indicanu cambiamenti in l'omeostasi è a dinamica mitocondriale sottu u stress PPA. Avemu successivamente esploratu parametri supplementari per caratterizà ulteriormente queste dinamiche è i potenziali meccanismi chì sò à a so basa.
L'acidu propionicu (PPA) rimodella a morfologia mitocondriale. (a) Immagini rappresentative di microscopia elettronica à trasmissione (TEM) chì mostranu chì a dimensione mitocondriale diminuisce è i mitocondri diventanu più chjuchi è più arrotondati cù l'aumentu di u trattamentu PPA; 0 mM (senza trattamentu), 3 mM è 5 mM, rispettivamente. E frecce rosse indicanu i mitocondri. (b-e) E cellule SH-SY5Y trattate cù PPA per 24 ore sò state preparate per TEM è i risultati sò stati analizati cù Fiji/ImageJ. Quattru di l'ottu parametri anu mostratu differenze significative trà e cellule di cuntrollu (senza trattamentu, 0 mM PPA) è e cellule trattate (3 mM è 5 mM PPA). (b) Regione 2, (c) Area, (d) Perimetru, (e) Diametru di Feret. L'analisi unidirezionale di a varianza (cuntrollu vs. trattamentu) è u test di paragone multiplu di Dunnett sò stati aduprati per determinà differenze significative (p < 0,05). I punti di dati rapprisentanu u valore mitocondriale mediu per ogni cellula individuale, è e barre d'errore rapprisentanu a media ± SEM. I dati mostrati rapprisentanu n = 3, almenu 24 cellule per replica; un totale di 266 immagini sò state analizzate; * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01.
Per caratterizà megliu cumu a dinamica mitocondriale risponde à u PPA, avemu culuritu i mitocondri cù estere etilico di tetrametilrodamina (TMRE) è avemu utilizatu a microscopia time-lapse è l'analisi MEL per localizà è quantificà i mitocondri dopu à 24 ore à 3 è 5 mM PPA. Trattamentu di eventi di fissione è fusione. (Fig. 2a). Dopu l'analisi MEL, i mitocondri sò stati ulteriormente analizzati per quantificà u numeru di strutture mitocondriali è u so vulume mediu. Avemu osservatu un picculu ma significativu aumentu di u numeru di eventi di fissione chì si verificanu à 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] paragunatu à a fissione [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] è a fusione [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] è a fusione [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] sò stati significativamente aumentati à 5 mM paragunatu à u cuntrollu (Fig. 3b). U numeru di mitocondri hè aumentatu significativamente sia à 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] sia à 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), mentre chì u vulume mediu di ogni struttura mitocondriale hè restatu invariatu (Fig. 3c). 3d). Pigliati inseme, questu suggerisce chì u rimodellamentu di a dinamica mitocondriale serve cum'è una risposta compensatoria chì mantene cù successu l'integrità di a rete mitocondriale. L'aumentu di u numeru di eventi di fissione à 3 mM PPA suggerisce chì l'aumentu di u numeru mitocondriale hè in parte duvutu à a fissione mitocondriale, ma datu chì u vulume mitocondriale mediu ferma essenzialmente invariatu, a biogenesi ùn pò esse esclusa cum'è una risposta compensatoria supplementaria. Tuttavia, questi dati sò coerenti cù e strutture mitocondriali più chjuche è tonde osservate da TEM è dimustranu ancu cambiamenti significativi in ​​a dinamica mitocondriale indotta da PPA.
L'acidu propionicu (PPA) induce u rimodellamentu mitocondriale dinamicu per mantene l'integrità di a rete. E cellule SH-SY5Y sò state cultivate, trattate cù 3 è 5 mM PPA per 24 ore è colorate cù TMRE è Hoechst 33342 seguitate da analisi MEL. (a) Immagini rappresentative di microscopia time-lapse chì mostranu u culore è e proiezioni di massima intensità binarizzate à u tempu 2 (t2) per ogni cundizione. E regioni selezziunate indicate in ogni maghjina binaria sò migliorate è visualizzate in 3D in trè diversi intervalli di tempu (t1-t3) per illustrà a dinamica in u tempu; l'eventi di fusione sò evidenziati in verde; l'eventi di fissione sò evidenziati in verde. Visualizzatu in rossu. (b) Numeru mediu di eventi dinamici per cundizione. (c) Numeru mediu di strutture mitocondriali per cellula. (d) Volume mediu (µm3) di ogni struttura mitocondriale per cellula. I dati mostrati sò rappresentativi di n = 15 cellule per gruppu di trattamentu. E barre d'errore mostrate rapprisentanu a media ± SEM, barra di scala = 10 μm, * p < 0,05.
L'acidu propionicu (PPA) provoca a soppressione trascrizionale di i geni assuciati à a dinamica mitocondriale. E cellule SH-SY5Y sò state trattate cù 3 è 5 mM PPA per 24 ore. A quantificazione relativa di i geni hè stata effettuata cù RT-qPCR è nurmalizzata à B2M. Geni di biogenesi mitocondriale (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 è (d) NFE2L2. Geni di fusione è fissione mitocondriale (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 è (i) DRP1. Differenze significative (p < 0,05) sò state testate cù ANOVA à una via (cuntrollu vs. trattamentu) è u test di paragone multiplu di Dunnett: * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01, è **** indica p < 0,0001. E barre rapprisentanu l'espressione media ± SEM. I dati mostrati rapprisentanu n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), è n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) repliche biologiche.
I dati di l'analisi TEM è MEL inseme indicanu chì u PPA altera a morfologia è a dinamica mitocondriale. Tuttavia, queste tecniche d'imaghjini ùn furniscenu micca infurmazioni nantu à i meccanismi sottostanti chì guidanu questi prucessi. Dunque, avemu esaminatu l'espressione di mRNA di nove regulatori chjave di a dinamica mitocondriale, a biogenesi è a mitosi in risposta à u trattamentu cù PPA. Avemu quantificatu l'oncogene di u mieloma cellulare (cMYC), u fattore respiratoriu nucleare (NRF1), u fattore di trascrizione mitocondriale 1 (TFAM), u fattore di trascrizione simile à NFE2 BZIP (NFE2L2), a proteina simile à a gastrina 2 (STOML2), l'atrofia di u nervu otticu 1 (OPA1), a Mitofusina 1 (MFN1), a Mitofusina 2 (MFN2) è a proteina correlata à a dinamina 1 (DRP1) dopu à 24 ore di trattamentu cù 3 mM è 5 mM di PPA. Avemu osservatu un trattamentu PPA di 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 è p < 0,0001, rispettivamente) è 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001). (Fig. 3a-c). A diminuzione di l'espressione di l'mRNA era dipendente da a dose: l'espressione di cMYC, NRF1 è TFAM hè diminuita di 5,7, 2,6 è 1,9 volte à 3 mM, rispettivamente, è di 11,2, 3 è 2,2 volte à 5 mM. In cuntrastu, u genu di biogenesi redox centrale NFE2L2 ùn hè statu alteratu à alcuna concentrazione di PPA, ancu s'è una tendenza simile dipendente da a dose di diminuzione di l'espressione hè stata osservata (Fig. 3d).
Avemu ancu esaminatu l'espressione di i geni classici implicati in a regulazione di a fissione è di a fusione. Si pensa chì STOML2 hè implicatu in a fusione, a mitofagia è a biogenesi, è a so espressione hè stata significativamente ridutta (p < 0,0001) da 3 mM (cambiamentu di 2,4 volte) è 5 mM (cambiamentu di 2,8 volte) PPA (Fig. 1). 3d). Similmente, l'espressione di u genu di fusione OPA1 hè stata diminuita à 3 mM (cambiamentu di 1,6 volte) è 5 mM (cambiamentu di 1,9 volte) PPA (p = 0,006 è p = 0,0024, rispettivamente) (Fig. 3f). Tuttavia, ùn avemu micca trovu differenze significative in l'espressione di i geni di fusione MFN1, MFN2 o di u genu di fissione DRP1 sottu stress PPA di 24 ore (Fig. 3g-i). Inoltre, avemu trovu chì i livelli di quattru proteine ​​di fusione è fissione (OPA1, MFN1, MFN2 è DRP1) ùn sò micca cambiati in e stesse cundizioni (Fig. 4a-d). Hè impurtante nutà chì sti dati riflettenu un unicu puntu in u tempu è ùn ponu micca riflette i cambiamenti in l'espressione di e proteine ​​o in i livelli di attività durante e prime fasi di u stress PPA. Tuttavia, riduzioni significative in l'espressione di cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 è OPA1 indicanu una disregulazione trascrizionale significativa di u metabolismu mitocondriale, a biogenesi è a dinamica. Inoltre, sti dati mettenu in risaltu l'utilità di e tecniche d'imaging per studià direttamente i cambiamenti di statu finale in a funzione mitocondriale.
I livelli di proteine ​​di fusione è di fissione ùn sò micca cambiati dopu u trattamentu cù l'acidu propionicu (PPA). E cellule SH-SY5Y sò state trattate cù 3 è 5 mM PPA per 24 ore. I livelli di proteine ​​sò stati quantificati per analisi Western blot, è i livelli di espressione sò stati nurmalizati à a proteina tutale. Sò mostrate l'espressione media di e proteine ​​è i Western blots rappresentativi di a proteina bersagliu è tutale. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. E barre rapprisentanu a media ± SEM, è i dati mostrati sò rappresentativi di n = 3 repliche biologiche. Sò state realizate paraguni multipli (p < 0,05) utilizendu l'analisi di varianza à una via è u test di Dunnett. U gel è u blot originali sò mostrati in a Figura S1.
A disfunzione mitocondriale hè assuciata à e malatie multisistemiche chì vanu da e malatie metaboliche, cardiovascolari è musculari à e malatie neurologiche1,10. Parechje malatie neurodegenerative è neurodegenerative sò assuciate à a disfunzione mitocondriale, mettendu in risaltu l'impurtanza di sti organelli in tutta a vita di u cervellu. Queste malatie includenu a malatia di Parkinson, a malatia d'Alzheimer è l'ASD3,4,18. Tuttavia, l'accessu à u tissutu cerebrale per studià queste malatie hè difficiule, in particulare à u livellu mecanicisticu, rendendu i sistemi di mudelli cellulari una alternativa necessaria. In questu studiu, usemu un sistema di mudelli cellulari chì utilizza cellule SH-SY5Y trattate cù PPA per ricapitulà a disfunzione mitocondriale osservata in e malatie neuronali, in particulare i disordini di u spettru autisticu. L'usu di questu mudellu PPA per studià a dinamica mitocondriale in i neuroni pò furnisce informazioni nantu à l'etiologia di l'ASD.
Avemu esploratu a pussibilità di utilizà TEM per vede i cambiamenti in a morfologia mitocondriale. Hè impurtante nutà chì TEM deve esse adupratu currettamente per massimizà a so efficacia. A preparazione di crio-specimeni permette una megliu preservazione di e strutture neuronali fissendu simultaneamente i cumpunenti cellulari è riducendu a furmazione di artefatti34. In cunfurmità cù questu, avemu osservatu chì e cellule SH-SY5Y simili à i neuroni avianu organelli subcellulari intatti è mitocondri allungati (Fig. 1a). Questu mette in risaltu l'utilità di e tecniche di preparazione criogenica per studià a morfologia mitocondriale in i mudelli di cellule neuronali. Ancu se e misurazioni quantitative sò critiche per l'analisi obiettiva di i dati TEM, ùn ci hè ancu un consensu nantu à quali parametri specifici devenu esse misurati per cunfirmà i cambiamenti morfologichi mitocondriali. Basatu annantu à un gran numeru di studii chì anu esaminatu quantitativamente a morfologia mitocondriale17,31,32, avemu sviluppatu una pipeline automatizata di analisi di l'imagine mitocondriale chì misura ottu parametri morfologichi, vale à dì: area, area2, rapportu d'aspettu, perimetru, circularità, gradu, diametru di Feret è rotondità.
Trà elle, u PPA hà riduttu significativamente l'area 2, l'area, u perimetru è u diametru di Feret (Fig. 1b-e). Questu hà dimustratu chì i mitocondri sò diventati più chjuchi è più arrotondati, ciò chì hè coerente cù studii precedenti chì mostranu una diminuzione di l'area mitocondriale dopu à 72 ore di stress mitocondriale induttu da PPA30. Queste caratteristiche morfologiche ponu indicà a fissione mitocondriale, un prucessu necessariu per sequestrare i cumpunenti danneggiati da a rete mitocondriale per prumove a so degradazione per mezu di a mitofagia35,36,37. D’altronde, a diminuzione di a dimensione media mitocondriale pò esse assuciata à una biogenesi aumentata, chì si traduce in a furmazione di picculi mitocondri nascenti. L'aumentu di a fissione o di a biogenesi rapprisenta una risposta compensatoria per mantene a mitosi contr'à u stress mitocondriale. Tuttavia, a diminuzione di a crescita mitocondriale, a fusione alterata o altre cundizioni ùn ponu esse escluse.
Ancu s'è l'imagine à alta risoluzione create da TEM permettenu a determinazione di e caratteristiche morfologiche à u livellu di i mitocondri individuali, stu metudu produce istantanee bidimensionali in un unicu puntu in u tempu. Per studià e risposte dinamiche à u stress metabolicu, avemu culuritu i mitocondri cù TMRE è utilizatu a microscopia time-lapse cù l'analisi MEL, chì permette una visualizazione 3D à altu rendimentu di i cambiamenti in a rete mitocondriale in u tempu33,38. Avemu osservatu cambiamenti suttili ma significativi in ​​a dinamica mitocondriale sottu à u stress PPA (Fig. 2). À 3 mM, u numeru di eventi di fissione hè aumentatu significativamente, mentre chì l'eventi di fusione sò rimasti listessi cum'è in u cuntrollu. Un aumentu di u numeru di eventi di fissione è di fusione hè statu osservatu à 5 mM PPA, ma questi cambiamenti eranu apprussimativamente proporzionali, ciò chì suggerisce chì a cinetica di fissione è di fusione righjunghji l'equilibriu à concentrazioni più elevate (Fig. 2b). U vulume mitocondriale mediu hè restatu invariatu sia à 3 sia à 5 mM PPA, ciò chì indica chì l'integrità di a rete mitocondriale hè stata cunservata (Fig. 2d). Questu riflette a capacità di e rete mitocondriali dinamiche di risponde à un stress metabolicu lieve per mantene efficacemente l'omeostasi senza causà frammentazione di a rete. À 3 mM PPA, l'aumentu di a fissione hè sufficiente per prumove a transizione versu un novu equilibriu, ma hè necessariu un rimodellamentu cineticu più prufondu in risposta à u stress induttu da concentrazioni più elevate di PPA.
U numeru di mitocondri hè aumentatu à e duie concentrazioni di stress PPA, ma u vulume mitocondriale mediu ùn hè micca cambiatu significativamente (Fig. 2c). Questu pò esse duvutu à una biogenesi aumentata o à una divisione aumentata; tuttavia, in assenza di una diminuzione significativa di u vulume mitocondriale mediu, hè più prubabile chì a biosintesi aumenti. Tuttavia, i dati in a Figura 2 sustenenu l'esistenza di dui meccanismi compensatori: un aumentu di u numeru di eventi di fissione, coerente cù a sovra-regulazione di a fissione mitocondriale, è un aumentu di u numeru di eventi, coerente cù a biogenesi mitocondriale. In definitiva, a compensazione dinamica per u stress lieve pò custituisce di prucessi simultanei chì implicanu fissione, fusione, biogenesi è mitofagia. Ancu se l'autori precedenti anu dimustratu chì u PPA aumenta a mitosi30,39 è a mitofagia29, furnimu evidenze per u rimodellamentu di a fissione mitocondriale è di a dinamica di fusione in risposta à u PPA. Questi dati cunfermanu i cambiamenti morfologichi osservati da TEM è furniscenu una visione più approfondita di i meccanismi assuciati à a disfunzione mitocondriale indotta da PPA.
Siccomu nè l'analisi TEM nè l'analisi MEL ùn anu furnitu evidenze dirette di i meccanismi regulatori di i geni chì sò à a basa di i cambiamenti morfologichi osservati, avemu esaminatu l'espressione di l'RNA di i geni implicati in u metabolismu mitocondriale, a biogenesi è a dinamica. U proto-oncogene cMYC hè un fattore di trascrizione implicatu in a regulazione di i mitocondri, a glicolisi, u metabolismu di l'aminoacidi è di l'acidi grassi40. Inoltre, cMYC hè cunnisciutu per regulà l'espressione di quasi 600 geni mitocondriali implicati in a trascrizione mitocondriale, a traduzzione è l'assemblementu cumplessu, cumpresi NRF1 è TFAM41. NRF1 è TFAM sò dui regulatori cintrali di a mitosi, chì agiscenu à valle di PGC-1α per attivà a replicazione di u mtDNA. Questa via hè attivata da a segnalazione cAMP è AMPK è hè sensibile à a spesa energetica è à u stress metabolicu. Avemu ancu esaminatu NFE2L2, un regulatore redox di a biogenesi mitocondriale, per determinà se l'effetti di u PPA puderanu esse mediati da u stress ossidativu.
Ancu s'è l'espressione di NFE2L2 hè rimasta invariata, avemu trovu una diminuzione consistente dipendente da a dose in l'espressione di cMYC, NRF1 è TFAM dopu à 24 ore di trattamentu cù 3 mM è 5 mM PPA (Fig. 3a-c). A downregulation di l'espressione di cMYC hè stata precedentemente segnalata cum'è una risposta à u stress mitocondriale42, è à u cuntrariu, a downregulation di l'espressione di cMYC pò causà disfunzione mitocondriale rimodellendu u metabolismu mitocondriale, a connettività di rete è a polarizazione di a membrana43. Hè interessante nutà chì cMYC hè ancu implicatu in a regulazione di a fissione è a fusione mitocondriale42,43 è hè cunnisciutu per aumentà a fosforilazione di DRP1 è a lucalizazione mitocondriale durante a divisione cellulare44, è ancu per medià u rimodellamentu morfologicu mitocondriale in e cellule staminali neuronali45. Infatti, i fibroblasti deficienti di cMYC mostranu una dimensione mitocondriale ridutta, coerente cù i cambiamenti indotti da u stress PPA43. Questi dati illustranu una relazione interessante ma ancu pocu chjara trà cMYC è a dinamica mitocondriale, furnendu un target interessante per studii futuri di rimodellamentu indottu da u stress PPA.
A riduzione di NRF1 è TFAM hè coerente cù u rolu di cMYC cum'è un attivatore trascrizionale impurtante. Quessi dati sò ancu coerenti cù studii precedenti in cellule di cancru di u colon umanu chì mostranu chì PPA hà riduttu l'espressione di mRNA NRF1 à 22 ore, chì era assuciatu à a deplezione di ATP è hà aumentatu ROS46. Quessi autori anu ancu signalatu chì l'espressione di TFAM hè aumentata à 8,5 ore, ma hè vultata à i livelli di basa à 22 ore. In cuntrastu, Kim et al. (2019) anu dimustratu chì l'espressione di mRNA TFAM era significativamente diminuita dopu à 4 ore di stress PPA in cellule SH-SY5Y; tuttavia, dopu à 72 ore, l'espressione di proteine ​​TFAM era significativamente aumentata è u numeru di copie di mtDNA era significativamente aumentatu. Cusì, a diminuzione di u numeru di geni di biogenesi mitocondriale chì avemu osservatu dopu à 24 ore ùn esclude micca a pussibilità chì l'aumentu di u numeru di mitocondri sia assuciatu à l'attivazione di a biogenesi in momenti precedenti. Studi precedenti anu dimustratu chì u PPA aumenta significativamente l'mRNA è a proteina PGC-1α in e cellule SH-SY5Y à 4 ore è 30 minuti, mentre chì l'acidu propionicu migliora a biogenesi mitocondriale in l'epatociti di vitellu via PGC-1α à 12 ore è 39 minuti. Hè interessante nutà chì PGC-1α ùn hè micca solu un regulatore trascrizionale direttu di NRF1 è TFAM, ma hè statu ancu dimustratu chì regula l'attività di MFN2 è DRP1 regulendu a fissione è a fusione47. Pigliati inseme, questu mette in risaltu u strettu accoppiamentu di i meccanismi chì regulanu e risposte compensatorie mitocondriali indotte da u PPA. Inoltre, i nostri dati riflettenu una disregulazione significativa di a regulazione trascrizionale di a biogenesi è di u metabolismu sottu à u stress di u PPA.
I geni STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 è DRP1 sò trà i regulatori cintrali di a fissione, a fusione è a dinamica mitocondriale37,48,49. Ci sò parechji altri geni implicati in a dinamica mitocondriale, ma STOML2, OPA1 è MFN2 sò stati digià trovati metilati in modu differenziale in e coorti ASD,16 è parechji studii indipendenti anu riportatu cambiamenti in questi fattori di trascrizione in risposta à u stress mitocondriale50,51.52. L'espressione di OPA1 è STOML2 hè stata significativamente ridutta da u trattamentu PPA di 3 mM è 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 hè unu di i regulatori classici di a fusione mitocondriale per via di l'interazione diretta cù MFN1 è 2 è ghjoca un rolu in u rimodellamentu di e creste è a morfologia mitocondriale53. U rolu precisu di STOML2 in a dinamica mitocondriale ùn hè micca chjaru, ma l'evidenza suggerisce chì ghjoca un rolu in a fusione mitocondriale, a biogenesi è a mitofagia.
STOML2 hè implicatu in u mantenimentu di l'accoppiamentu respiratoriu mitocondriale è a furmazione di cumplessu di catena respiratoria54,55 è hè statu dimustratu chì altera prufundamente e caratteristiche metaboliche di e cellule cancerose56. Studi anu dimustratu chì STOML2 prumove u putenziale di membrana mitocondriale è a biogenesi per via di l'interazzione cù BAN è cardiolipina 55, 57, 58. Inoltre, studii indipendenti anu dimustratu chì l'interazzione trà STOML2 è PINK1 regula a mitofagia59,60. In particulare, hè statu signalatu chì STOML2 interagisce direttamente cù MFN2 è stabilizza è ghjoca ancu un rolu impurtante in a stabilizazione di e lunghe isoformi OPA1 inibendu a proteasi rispunsevule di a degradazione di OPA153,61,62. A riduzione di l'espressione di STOML2 osservata in e reazioni PPA pò rende queste proteine ​​di fusione più suscettibili à a degradazione per via di vie dipendenti da l'ubiquitina è da u proteasoma48. Ancu s'è u rolu precisu di STOML2 è OPA1 in a risposta dinamica à PPA ùn hè micca chjaru, a diminuzione di l'espressione di sti geni di fusione (Figura 3) pò disturbà l'equilibriu trà a fissione è a fusione è purtà à una diminuzione di a dimensione mitocondriale (Figura 3). 1).
Da l'altra parte, l'espressione di a proteina OPA1 hè rimasta invariata dopu à 24 ore, mentre chì i livelli di mRNA è di proteine ​​di MFN1, MFN2 o DRP1 ùn sò micca cambiati significativamente dopu à u trattamentu PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Questu pò indicà chì ùn ci sò micca cambiamenti in a regulazione di sti fattori implicati in a fusione è a fissione mitocondriale. Tuttavia, hè da nutà chì ognunu di sti quattru geni hè ancu regulatu da mudificazioni post-trascrizionali (PTM) chì cuntrolanu l'attività di e proteine. OPA1 hà ottu varianti di splicing alternative chì sò scisse proteoliticamente in i mitocondri per pruduce duie isoforme distinte 63. L'equilibriu trà isoforme lunghe è corte determina in definitiva u rolu di OPA1 in a fusione mitocondriale è u mantenimentu di a rete mitocondriale 64. L'attività DRP1 hè regulata da a fosforilazione di a proteina chinasi II dipendente da u calciu / calmodulina (CaMKII), mentre chì a degradazione di DRP1 hè regulata da l'ubiquitinazione è a SUMOilazione 65. Infine, sia DRP1 sia MFN1/2 sò GTPasi, dunque l'attività pò esse influenzata da a velocità di pruduzzione di GTP in i mitocondri 66. Dunque, ancu s'è l'espressione di ste proteine ​​ferma custante, questu ùn pò micca riflette l'attività o a lucalizazione di e proteine ​​invariate 67,68. Infatti, i repertori di proteine ​​PTM esistenti servenu spessu cum'è a prima linea di difesa rispunsevule di a mediazione di e risposte à u stress acutu. In presenza di stress metabolicu moderatu in u nostru mudellu, hè prubabile chì PTM prumove una maggiore attività di e proteine ​​di fusione è di fissione per restaurà sufficientemente l'integrità mitocondriale senza richiede una attivazione supplementare di sti geni à u livellu di l'mRNA o di e proteine.
Pigliati inseme, i dati sopra citati mettenu in risaltu a regulazione cumplessa è dipendente da u tempu di a morfologia mitocondriale è e sfide di elucidà questi meccanismi. Per studià l'espressione genica, hè prima necessariu identificà geni bersagliu specifichi in a via. Tuttavia, i nostri dati mostranu chì i geni in a stessa via ùn rispondenu micca in u listessu modu à u listessu stress. In fatti, studii precedenti anu dimustratu chì diversi geni in a stessa via ponu esibisce diversi profili di risposta temporale30,46. Inoltre, ci sò meccanismi post-trascrizionali cumplessi chì interrompenu a relazione trà a trascrizione è a funzione genica. I studii proteomichi ponu furnisce informazioni nantu à l'impattu di i PTM è di a funzione di e proteine, ma presentanu ancu sfide cumprese i metudi à bassu rendimentu, alti rapporti segnale-rumore è una scarsa risoluzione.
In questu cuntestu, studià a morfologia mitocondriale cù TEM è MEL hà un grande putenziale per affruntà dumande fundamentali nantu à a relazione trà a dinamica è a funzione mitocondriale è cumu questu influenza a malatia. Ancu più impurtante, TEM furnisce un metudu direttu per misurà a morfologia mitocondriale cum'è un endpoint convergente di disfunzione è dinamica mitocondriale51. MEL furnisce ancu un metudu direttu per visualizà eventi di fissione è fusione in un ambiente cellulare tridimensionale, chì permette a quantificazione di u rimodellamentu mitocondriale dinamicu ancu in assenza di cambiamenti in l'espressione genica33. Quì mettemu in risaltu l'utilità di e tecniche di imaging mitocondriale in e malatie mitocondriali secundarie. Queste malatie sò tipicamente carattarizate da un stress metabolicu lieve crònicu carattarizatu da un rimodellamentu suttile di e rete mitocondriali piuttostu chè da danni mitocondriali acuti. Tuttavia, a compensazione mitocondriale necessaria per mantene a mitosi sottu stress crònicu hà cunsequenze funziunali prufonde. In u cuntestu di e neuroscienze, una megliu comprensione di questi meccanismi compensatori pò furnisce informazioni impurtanti nantu à a neuropatologia pleiotropica assuciata à a disfunzione mitocondriale.
Infine, i nostri dati mettenu in risaltu l'utilità di e tecniche d'imaghjini per capisce e cunsequenze funziunali di l'interazioni cumplesse trà l'espressione genica, e mudificazioni di e proteine ​​è l'attività proteica chì cuntrolanu a dinamica mitocondriale neuronale. Avemu utilizatu PPA per mudellà a disfunzione mitocondriale in un mudellu di cellula neuronale per ottene informazioni nantu à a cumpunente mitocondriale di l'ASD. E cellule SH-SY5Y trattate cù PPA anu mostratu cambiamenti in a morfologia mitocondriale: i mitocondri sò diventati chjuchi è tondi, è e creste eranu pocu definite quandu osservate da TEM. L'analisi MEL mostra chì questi cambiamenti si verificanu in cuncomitanza cù un aumentu di l'eventi di fissione è di fusione per mantene a rete mitocondriale in risposta à un stress metabolicu lieve. Inoltre, u PPA interrompe significativamente a regulazione trascrizionale di u metabolismu mitocondriale è di l'omeostasi. Avemu identificatu cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 è OPA1 cum'è regulatori mitocondriali chjave interromputi da u stress PPA è ponu ghjucà un rolu in a mediazione di i cambiamenti indotti da PPA in a morfologia è a funzione mitocondriale. Studi futuri sò necessarii per caratterizà megliu i cambiamenti temporali indotti da PPA in l'espressione genica è l'attività proteica, a lucalizazione è e mudificazioni post-traduzionali. I nostri dati mettenu in risaltu a cumplessità è l'interdipendenza di i meccanismi regulatori chì medianu a risposta à u stress mitocondriale è dimustranu l'utilità di u TEM è di altre tecniche d'imaghjini per studii meccanismichi più mirati.
A linea cellulare SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) hè stata acquistata da Sigma-Aldrich. E cellule SH-SY5Y sò state cultivate in u mischju di nutrienti Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 (DMEM/F-12) è L-glutamina (SC09411, ScienCell) in fiaschi di 25 cm2 supplementati cù 20% di serum fetale bovinu (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) è 1% di penicillina-streptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) à 37 °C, 5% di CO2. E cellule sò state subcultivate à 80% di cunfluenza aduprendu 0,05% di tripsina-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugate à 300 g è piastrate à una densità di circa 7 × 105 cellule/ml. Tutti l'esperimenti sò stati realizati nantu à cellule SH-SY5Y indifferenziate trà i passaggi 19-22. U PPA hè amministratu cum'è NaP. Dissolve a polvere di NaP (CAS No. 137-40-6, formula chimica C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) in acqua calda MilliQ à una cuncentrazione di 1 M è cunservate à 4 °C. U ghjornu di u trattamentu, diluite sta suluzione cù 1 M PPA à 3 mM è 5 mM PPA in un mezu senza serum (DMEM/F-12 cù L-glutamina). E cuncentrazioni di trattamentu per tutti l'esperimenti eranu senza PPA (0 mM, cuntrollu), 3 mM è 5 mM PPA. L'esperimenti sò stati realizati in almenu trè repliche biologiche.
E cellule SH-SY5Y sò state seminate in fiaschi di 25 cm5 à una velocità di 5,5 × 105 cellule/ml è cresciute per 24 ore. U trattamentu PPA hè statu aghjuntu à u fiaschju prima di 24 ore d'incubazione. Raccoglie i pellet cellulari seguendu i protokolli nurmali di subcultura di tessuti di mammiferi (descritti sopra). Risuspende u pellet cellulare in 100 µl di glutaraldeide al 2,5%, 1× PBS è conserva à 4 °C finu à u processu. E cellule SH-SY5Y sò state brevemente centrifugate per pellettà e cellule è rimuovere a soluzione di glutaraldeide al 2,5%, 1× PBS. Risuspende u sedimentu in un gel d'agarosio al 4% preparatu in acqua distillata (u rapportu trà u vulume d'agarosio è u sedimentu hè 1:1). I pezzi d'agarosio sò stati posti nantu à griglie nantu à piastre piane è rivestiti cù 1-esadecene prima di a congelazione ad alta pressione. I campioni sò stati congelati in acetone seccu al 100% à -90 °C per 24 ore. A temperatura hè stata tandu purtata à -80 °C è hè stata aghjunta una suluzione di 1% di tetrossidu d'osmiu è 0,1% di glutaraldeide. I campioni sò stati cunservati à -80 °C per 24 ore. Dopu questu, a temperatura hè stata aumentata gradualmente à a temperatura ambiente per parechji ghjorni: da – 80 °C à – 50 °C per 24 ore, à – 30 °C per 24 ore, à – 10 °C per 24 ore è infine à a temperatura ambiente.
Dopu a preparazione criogenica, i campioni sò stati impregnati di resina è sezioni ultrafini (∼100 nm) sò state fatte cù un ultramicrotomu Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). E sezioni sò state colorate cù 2% d'acetatu d'uranile è citratu di piombu. I campioni sò stati osservati cù un microscopiu elettronicu à trasmissione FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (prima FEI), Eindhoven, Paesi Bassi) chì funziona à 200 kV (trasmettitore Lab6) è una camera CCD Gatan (Gatan, Regnu Unitu) dotata di un filtru d'energia Tridiem.
In ogni replica tecnica, sò state acquistate almenu 24 imagine di cellule singole, per un totale di 266 imagine. Tutte l'imagine sò state analizate aduprendu a macro Region of Interest (ROI) è a macro Mitochondria. A macro mitochondriale hè basata annantu à i metudi publicati17,31,32 è permette l'elaborazione in batch semi-automatica di l'imagine TEM in Fiji/ImageJ69. In poche parole: l'imagine hè invertita è invertita aduprendu a sottrazione di u fondu di a palla rotante (raghju di 60 pixel) è un filtru passa-banda FFT (aduprendu rispettivamente limiti superiori è inferiori di 60 è 8 pixel) è a soppressione di a linea verticale cù una tolleranza di orientazione di u 5%. L'imagine trattata hè automaticamente sogliata aduprendu un algoritmu di entropia massima è una maschera binaria hè generata. E regioni d'imagine assuciate à e ROI selezziunate manualmente in l'imagine TEM grezze sò state estratte, caratterizendu i mitochondri è escludendu a membrana plasmatica è altre regioni à altu cuntrastu. Per ogni ROI estrattu, sò state analizate e particelle binarie più grande di 600 pixel, è l'area di e particelle, u perimetru, l'assi maiò è minori, u diametru di Feret, a rotondità è a circularità sò stati misurati utilizendu e funzioni di misurazione integrate di Fiji/ImageJ. Seguendu Merrill, Flippo è Strack (2017), l'area 2, u rapportu d'aspettu di e particelle (rapportu trà l'assi maiò è minore) è u fattore di forma (FF) sò stati calculati da questi dati, induve FF = perimetru 2/4pi x area. A definizione di a formula parametrica si pò truvà in Merrill, Flippo è Strack (2017). E macro citate sò dispunibili nantu à GitHub (vede a Dichjarazione di Disponibilità di Dati). In media, sò state analizate circa 5.600 particelle per trattamentu PPA, per un totale di circa 17.000 particelle (dati micca mostrati).
E cellule SH-SH5Y sò state piazzate in piastre di cultura à 8 camere (ThermoFisher, #155411) per permette l'adesione durante a notte è dopu incubate cù TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) è Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). tintura. L'imaghjini sò state acquistate aduprendu laser à 405 nm è 561 nm in un ambiente di 10 minuti, è l'imaghjini grezze sò state acquistate cum'è z-stacks cuntenenti 10 micrografie d'imaghjini cù un passu az di 0,2 μm trà i fotogrammi d'imaghjini à 12 punti di tempu successivi. L'imaghjini sò state raccolte aduprendu una piattaforma di super-risoluzione Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germania) aduprendu una lente LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. L'imagine sò state analizate in ImageJ aduprendu una pipeline descritta prima è u plugin ImageJ per misurà l'eventi di fusione è fissione, u numeru mediu di strutture mitocondriali è u vulume mitocondriale mediu per cellula33. E macro MEL sò dispunibili nantu à GitHub (vede a Dichjarazione di Disponibilità di Dati).
E cellule SH-SY5Y sò state cultivate in piastre à sei pozzetti à una densità di 0,3 × 106 cellule/mL per 24 ore prima di u trattamentu. L'ARN hè statu estrattu utilizendu u protocolu Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) cù lievi mudificazioni: aghjunghje 300 μl di buffer di lisi di l'ARN à ogni pozzettu prima di a rimozione è lisà ogni campione cum'è passu finale cù 30 μl di eluzione DNasi/RNasi. Acqua senza acqua. Tutti i campioni sò stati verificati per quantità è qualità utilizendu un Spettrofotometru UV-Vis NanoDrop ND-1000. A proteina tutale da i lisati cellulari hè stata ottenuta utilizendu 200 μl di buffer di lisi RIPA, è a cuncentrazione di proteine ​​hè stata quantificata utilizendu u test di proteine ​​Bradford70.
A sintesi di cDNA hè stata realizata cù u Kit di Sintesi di cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) secondu l'istruzzioni di u fabricatore cù alcune mudificazioni. U cDNA hè statu sintetizatu in reazioni di 20 μl utilizendu da 0,7 à 1 μg di RNA tutale. I primer sò stati selezziunati da articuli publicati prima 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabella S1) è e sonde accumpagnate sò state cuncepite utilizendu u strumentu PrimerQuest di Integrated DNA Technologies. Tutti i geni d'interessu sò stati nurmalizati à u genu nucleare B2M. L'espressione genica di STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC è OPA1 hè stata misurata da RT-qPCR. A miscela maestra includeva LUNA Taq polimerasi (M3003L, New England Biolabs), 10 μM di primer diretti è inversi, cDNA è acqua di qualità PCR per ottene un volume finale di 10 μL per ogni reazione. L'espressione di i geni di divisione è fissione (DRP1, MFN1/2) hè stata misurata utilizendu saggi multiplex TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) hè stata aduprata secondu l'istruzzioni di u fabricatore cù modifiche minori. A miscela maestra RT-qPCR multiplex include 1X LUNA Taq polimerasi, 10 μM di primer diretti è inversi, 10 μM di sonda, cDNA è acqua di qualità PCR, risultendu in un volume finale di 20 μL per ogni reazione. RT-qPCR hè stata realizata utilizendu Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG - numeru di serie: R0618110). E cundizioni di ciclaggio sò mostrate in a Tabella S1. Tutti i campioni di cDNA sò stati amplificati in triplicatu è una curva standard hè stata generata aduprendu una seria di diluizioni dece volte. I valori anomali in i campioni triplicati cù una deviazione standard di a soglia di u ciclu (Ct) > 0,5 sò stati eliminati da l'analisi per assicurà a riproducibilità di i dati30,72. L'espressione genica relativa hè stata calculata aduprendu u metudu 2-ΔΔCt79.
I campioni di proteine ​​(60 μg) sò stati mischiati cù un buffer di carica Laemmli à un rapportu 2:1 è eseguiti nantu à un gel di proteine ​​incolore à 12% (Bio-Rad #1610184). E proteine ​​sò state trasferite à una membrana PVDF (fluoruru di polivinilidene) (#170-84156, Bio-Rad) utilizendu u sistema Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). A membrana hè stata bluccata è incubata cù l'anticorpi primari adatti (OPA1, MFN1, MFN2 è DRP1) (diluiti 1:1000) per 48 ore, seguita da incubazione cù anticorpi secundarii (1:10.000) per 1 ora. E membrane sò state poi fotografate utilizendu u substratu Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) è registrate utilizendu un sistema Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab versione 6.1 hè stata utilizata per l'analisi Western blot. U gel è a macchia uriginali sò mostrati in a Figura S1. L'infurmazioni nantu à l'anticorpi sò furnite in a Tavula S2.
I gruppi di dati sò presentati cum'è a media è l'errore standard di a media (SEM) di almenu trè campioni indipendenti. I gruppi di dati sò stati testati per a nurmalità utilizendu u test di Shapiro-Wilks (salvo indicazione contraria) prima di assume una distribuzione gaussiana è deviazioni standard uguali è di procedere cù l'analisi. In più di analizà u gruppu di dati utilizendu Fisher's MEL LSD (p < 0,05), ANOVA à una via (media di trattamentu vs. cuntrollu) è u test di paragone multiplu di Dunnett per determinà a significatività (p < 0,05). I valori p significativi sò mostrati in u graficu cum'è *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Tutte l'analisi statistiche è i grafici sò stati realizati è generati utilizendu GraphPad Prism 9.4.0.
E macro Fiji/ImageJ per l'analisi d'imagine TEM sò dispunibili publicamente nantu à GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. A macro Mitochondrial Event Locator (MEL) hè dispunibule publicamente nantu à GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
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