Presente *Indirizzu attuale: Colonia 50931, Germania, Cluster d'Eccellenza di Colonia Ricerca nantu à a Risposta à u Stress Cellulare in e Malatie Legate à l'Invecchiamento (CECAD).
A neurodegenerazione di e malatie mitocondriali hè cunsiderata irreversibile perchè a plasticità metabolica di i neuroni hè limitata, ma l'effettu di a disfunzione mitocondriale nantu à l'autonomia cellulare di u metabolismu neuronale in u corpu hè pocu capitu. Quì, introducemu u proteoma specificu di e cellule di i neuroni di Purkinje cù una carenza progressiva di OXPHOS causata da una dinamica di fusione mitocondriale interrotta. Avemu trovu chì a disfunzione mitocondriale hà scatenatu un cambiamentu prufondu in u campu di a proteomica, chì hà purtatu infine à l'attivazione sequenziale di prugrammi metabolichi precisi prima di a morte cellulare. Inaspettatamente, avemu determinatu l'evidente induzione di a piruvato carbossilasi (PCx) è altri enzimi anti-invecchiamento chì cumplementanu l'intermedi di u ciclu TCA. L'inibizione di PCx hà aggravatu u stress ossidativu è a neurodegenerazione, indicendu chì l'aterosclerosi hà un effettu protettivu in i neuroni chì mancanu di OXPHOS. A restaurazione di a fusione mitocondriale in i neuroni degenerati terminalmente inverte cumpletamente queste caratteristiche metaboliche, impedendu cusì a morte cellulare. I nostri risultati identificanu percorsi precedentemente scunnisciuti chì cunferiscenu resilienza à a disfunzione mitocondriale è mostranu chì a neurodegenerazione pò esse invertita ancu in e fasi tardive di a malattia.
U rollu cintrali di i mitocondri in u mantenimentu di u metabolismu energeticu neuronale hè messu in risaltu da i sintomi neurologichi estensivi assuciati à e malatie mitocondriali umane. A maiò parte di ste malatie sò causate da mutazioni genetiche chì regulanu l'espressione genica mitocondriale (1, 2) o a distruzzione di geni ligata à a dinamica mitocondriale, chì influenzanu indirettamente a stabilità di u DNA mitocondriale (mtDNA) (3, 4). U travagliu in mudelli animali hà dimustratu chì in risposta à a disfunzione mitocondriale in i tessuti circundanti, e vie metaboliche cunservative (5-7) ponu esse attivate, ciò chì furnisce informazioni impurtanti per una comprensione approfondita di a patogenesi di ste malatie cumplesse. In cuntrastu, a nostra comprensione di i cambiamenti metabolichi di tipi di cellule specifici causati da u fallimentu generale di a pruduzzione di adenosina trifosfatu (ATP) mitocondriale cerebrale hè fundamentale (8), mettendu in risaltu a necessità di identificà obiettivi terapeutichi chì ponu esse aduprati per prevene o prevene e malatie. Prevenisce a neurodegenerazione (9). A mancanza d'infurmazioni hè u fattu chì e cellule nervose sò largamente cunsiderate cum'è avè una flessibilità metabolica assai limitata paragunata à i tipi di cellule di i tessuti circundanti (10). Datu chì ste cellule ghjocanu un rollu cintrali in a cuurdinatura di l'approvvigionamentu di metaboliti à i neuroni per prumove a trasmissione sinaptica è risponde à e cundizioni di ferite è malatie, a capacità di adattà u metabolismu cellulare à e cundizioni difficili di u tissutu cerebrale hè guasi limitata à e cellule gliali (11-14). Inoltre, l'eterogeneità cellulare inerente di u tissutu cerebrale impedisce in gran parte u studiu di i cambiamenti metabolichi chì si verificanu in specifici sottogruppi neuronali. Di cunsiguenza, si sà pocu nantu à e cunsequenze cellulari è metaboliche esatte di a disfunzione mitocondriale in i neuroni.
Per capisce e cunsequenze metaboliche di a disfunzione mitocondriale, avemu isolatu i neuroni di Purkinje (PN) in diverse fasi di neurodegenerazione causata da a distruzzione di a fusione di a membrana esterna mitocondriale (Mfn2). Ancu s'è e mutazioni di Mfn2 in l'omu sò assuciate à una forma di neuropatia sensoriale motoria ereditaria cunnisciuta cum'è Charcot-Marie-Tooth tipu 2A (15), a distruzzione cundiziunale di Mfn2 in i topi hè un metudu di disfunzione di fosforilazione di l'ossidazione (OXPHOS) ben ricunnisciutu. I vari sottotipi neuronali (16-19) è u fenotipu neurodegenerativu risultante sò accumpagnati da sintomi neurologichi progressivi, cum'è i disordini di u muvimentu (18, 19) o l'atassia cerebellare (16). Usendu una cumminazione di proteomica quantitativa senza marcatore (LFQ), metabolomica, imaging è metudi virologichi, mostremu chì a neurodegenerazione progressiva induce fortemente a carbossilasi di a piruvatu (PCx) è altri fattori implicati in l'arteriosclerosi di e PN in vivo. L'espressione di l'enzimi. Per verificà a rilevanza di sta scuperta, avemu specificamente diminuitu l'espressione di PCx in PN cun deficit di Mfn2, è avemu trovu chì sta operazione aggravava u stress ossidativu è accelerava a neurodegenerazione, dimustrendu cusì chì l'azoospermia cunferisce a morte cellulare Adattabilità metabolica. L'espressione severa di MFN2 pò salvà cumpletamente a degenerazione terminale PN cù una grave carenza di OXPHOS, un cunsumu massivu di DNA mitocondriale è una rete mitocondriale apparentemente rotta, ciò chì mette in risaltu ulteriormente chì sta forma di neurodegenerazione pò ancu ricuperà in u stadiu avanzatu di a malattia prima di a morte cellulare.
Per visualizà i mitocondri in i PN knockout Mfn2, avemu utilizatu una ceppa di topi chì permette à i mitocondri dipendenti da Cre di indirizzà l'espressione di Cre di a proteina fluorescente gialla (YFP) (mtYFP) (20) è verificatu a morfologia mitocondriale in vivo. Avemu trovu chì a distruzzione di u genu Mfn2 in i PN purteria à a divisione graduale di a rete mitocondriale (Figura S1A), è u cambiamentu u più prestu hè statu trovu à 3 settimane di età. In cuntrastu, a degenerazione sustanziale di u stratu cellulare PN, cum'è evidenziatu da a perdita di l'immunocolorazione di Calbindina, ùn hà cuminciatu finu à 12 settimane di età (Figura 1, A è B). A discrepanza di tempu trà i primi cambiamenti in a morfologia mitocondriale è l'iniziu visibile di a morte neuronale ci hà incitatu à investigà i cambiamenti metabolichi scatenati da a disfunzione mitocondriale prima di a morte cellulare. Avemu sviluppatu una strategia basata nantu à l'urdinamentu di cellule attivate da fluorescenza (FACS) per isolà PN chì esprimenu YFP (YFP+) (Figura 1C), è in topi di cuntrollu (Mfn2+ / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), in seguitu chjamati CTRL (Figura S1B). L'ottimisazione di a strategia di gating basata nantu à l'intensità relativa di u signale YFP ci permette di purificà u corpu YFP+ (YFPhigh) di PN da non-PN (YFPneg) (Figura S1B) o putativi frammenti fluorescenti di assoni/dendritici (YFPlow; Figura S1D, sinistra), cunfirmati da microscopiu cunfocale (Figura S1D, diritta). Per verificà l'identità di a pupulazione classificata, avemu realizatu a proteomica LFQ è dopu l'analisi di i cumpunenti principali, è avemu trovu chì ci hè una chiara separazione trà e cellule YFPhigh è YFPneg (Figura S1C). E cellule YFPhigh anu mostratu un arricchimentu netu di marcatori PN cunnisciuti (vale à dì Calb1, Pcp2, Grid2 è Itpr3) (21, 22), ma nisun arricchimentu di proteine ​​​​comunemente espresse in neuroni o altri tipi di cellule (Figura 1D)). Una paragone trà campioni in cellule YFPhigh classificate raccolte in esperimenti indipendenti hà mostratu un coefficientu di currelazione > 0,9, dimustrendu una bona riproducibilità trà repliche biologiche (Figura S1E). In riassuntu, questi dati anu validatu u nostru pianu per l'isolamentu acutu è specificu di PN fattibile. Siccome u sistema driver L7-cre utilizatu induce a ricombinazione mosaica in a prima settimana dopu à u partu (23), avemu cuminciatu à abbatte i topi da CTRL è cundiziunale (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Raccoglie i neuroni. Dopu chì a ricombinazione hè cumpletata, hè chjamata Mfn2cKO à 4 settimane di età. Cum'è puntu finale, avemu sceltu 8 settimane di età quandu u stratu PN era intattu malgradu l'evidente frammentazione mitocondriale (Figura 1B è Figura S1A). In tutale, avemu quantificatu un tutale di 3013 proteine, di e quali circa u 22% eranu basate nantu à l'annotazioni MitoCarta 2.0 basate nantu à u proteoma mitocondriale cum'è mitocondri (Figura 1E) (Figura 1E) (24). L'analisi di l'espressione genica differenziale realizata à a settimana 8 hà dimustratu chì solu u 10,5% di tutte e proteine ​​avianu cambiamenti significativi (Figura 1F è Figura S1F), di e quali 195 proteine ​​eranu sotturegulate è 120 proteine ​​eranu sovraregulate (Figura 1F). Vale a pena nutà chì l'"analisi di e vie innovative" di questu inseme di dati mostra chì i geni espressi in modu differenziale appartenenu principalmente à un inseme ristrettu di vie metaboliche specifiche (Figura 1G). Hè interessante nutà chì, ancu s'è a sotturegulazione di e vie relative à OXPHOS è a segnalazione di u calciu cunfirma l'induzione di a disfunzione mitocondriale in e PN cun deficit di fusione, altre categurie chì implicanu principalmente u metabolismu di l'aminoacidi sò significativamente sovraregulate, ciò chì hè in linea cù u metabolismu chì si verifica in e PN mitocondriali. U ricablaggio hè consistente.
(A) Fotografie cunfocali rappresentative di sezioni cerebellari di topi CTRL è Mfn2cKO chì mostranu una perdita progressiva di PN (calbindina, grisgia); i nuclei sò stati cuntracolorati cù DAPI. (B) Quantificazione di (A) (analisi di varianza à una via, ***P<0,001; n = da 4 à 6 cerchi da trè topi). (C) Flussu di travagliu sperimentale. (D) Distribuzione di a mappa di calore di marcatori specifichi per Purkinje (in cima) è altri tipi di cellule (in mezu). (E) Diagramma di Venn chì mostra u numeru di proteine ​​mitocondriali identificate in a PN classificata. (F) Graficu di vulcano di proteine ​​espresse in modu differenziale in i neuroni Mfn2cKO à 8 settimane (valore limite di significatività di 1,3). (G) L'analisi di a via di creatività mostra e cinque vie di sovra-regulazione (rossa) è di sotto-regulazione (blu) più impurtanti in a PN Mfn2cKO classificata cum'è 8 settimane. Hè mostratu u livellu mediu di espressione di ogni proteina rilevata. Mappa di calore in scala di grigi: valore P aghjustatu. ns, micca impurtante.
I dati proteomichi anu dimustratu chì l'espressione di e proteine ​​di i cumplessi I, III è IV hè diminuita gradualmente. I cumplessi I, III è IV cuntenenu tutti subunità essenziali codificate da u mtDNA, mentre chì u cumplessu II, chì era solu codificatu nucleare, era basicamente invariatu (Figura 2A è Figura S2A). . In cunfurmità cù i risultati proteomichi, l'immunoistochimica di e sezioni di tissutu cerebellare hà dimustratu chì u livellu di a subunità MTCO1 (subunità 1 di u citocromu C ossidasi mitocondriale) di u cumplessu IV in PN hè diminuitu gradualmente (Figura 2B). A subunità Mtatp8 codificata da u mtDNA hè stata significativamente ridutta (Figura S2A), mentre chì u livellu di statu stazionariu di a subunità ATP sintasi codificata nucleare hè restatu invariatu, ciò chì hè coerente cù u cumplessu F1 di u sottoassemblaggio di ATP sintasi stabile cunnisciutu quandu l'espressione di u mtDNA hè stabile. A furmazione hè coerente. Interruzzione (7). A valutazione di u livellu di mtDNA in i PN Mfn2cKO urdinati per reazione in catena di a polimerasi in tempu reale (qPCR) hà cunfirmatu a diminuzione graduale di u numeru di copie di mtDNA. In paragone cù u gruppu di cuntrollu, à 8 settimane d'età, solu circa u 20% di u livellu di mtDNA hè statu ritenutu (Figura 2C). In cunfurmità cù questi risultati, a culurazione per microscopia cunfocale di i PN Mfn2cKO hè stata aduprata per rilevà u DNA, mustrendu u cunsumu dipendente da u tempu di nucleotidi mitocondriali (Figura 2D). Avemu trovu chì solu alcuni candidati implicati in a degradazione di e proteine ​​mitocondriali è a risposta à u stress eranu sovraregulati, cumpresi Lonp1, Afg3l2 è Clpx, è i fattori di assemblaggio cumplessu OXPHOS. Nisun cambiamentu significativu in i livelli di proteine ​​implicate in l'apoptosi hè statu rilevatu (Figura S2B). In listessu modu, avemu trovu chì i canali mitocondriali è di u reticulu endoplasmicu implicati in u trasportu di calciu anu solu cambiamenti minori (Figura S2C). Inoltre, a valutazione di e proteine ​​​​​​legate à l'autofagia ùn hà trovu cambiamenti significativi, ciò chì hè coerente cù l'induzione visibile di autofagosomi osservata in vivo per immunoistochimica è microscopia elettronica (Figura S3). Tuttavia, a disfunzione OXPHOS progressiva in i PN hè accumpagnata da evidenti cambiamenti mitocondriali ultrastrutturali. I gruppi mitocondriali ponu esse visti in i corpi cellulari è l'arburi dendritici di i PN Mfn2cKO di età compresa tra 5 è 8 settimane, è a struttura di a membrana interna hà subitu cambiamenti profondi (Figura S4, A è B). Coerente cù questi cambiamenti ultrastrutturali è una diminuzione significativa di u mtDNA, l'analisi di fette cerebellari cerebrali acute cù estere metilico di tetrametilrodamina (TMRM) hà dimustratu chì u putenziale di membrana mitocondriale in i PN Mfn2cKO era significativamente diminuitu (Figura S4C).
(A) Analisi di u corsu di u tempu di u livellu d'espressione di u cumplessu OXPHOS. Cunsiderate solu e proteine ​​cù P<0,05 à 8 settimane (ANOVA à duie vie). Linea punteggiata: Nisuna aghjustamentu paragunata à CTRL. (B) Sinistra: Un esempiu di una sezione cerebellare marcata cù anticorpu anti-MTCO1 (barra di scala, 20 μm). L'area occupata da i corpi cellulari di Purkinje hè cuperta da u giallu. Destra: Quantificazione di i livelli di MTCO1 (analisi di varianza à una via; n = da 7 à 20 cellule analizzate da trè topi). (C) Analisi qPCR di u numeru di copie di mtDNA in u PN ordinatu (analisi di varianza à una via; n = da 3 à 7 topi). (D) Sinistra: Un esempiu di una fetta cerebellare marcata cù un anticorpu anti-DNA (barra di scala, 20 μm). L'area occupata da i corpi cellulari di Purkinje hè cuperta da u giallu. Destra: Quantificazione di e lesioni di u mtDNA (analisi di varianza à una via; n = da 5 à 9 cellule da trè topi). (E) Un esempiu di una sezione cerebellare acuta chì mostra e cellule mitoYFP + Purkinje (freccia) in una registrazione di patch clamp di cellule intere. (F) Quantificazione di a curva IV. (G) Registrazioni rappresentative di l'iniezione di corrente depolarizzante in cellule di Purkinje CTRL è Mfn2cKO. Traccia superiore: U primu impulsu chì hà scatenatu AP. Traccia inferiore: Frequenza massima di AP. (H) Quantificazione di input spontanei postsinaptici (sPSP). A traccia di registrazione rappresentativa è u so rapportu di zoom sò mostrati in (I). Analisi unidirezionale di a varianza analizzata da n = 5 à 20 cellule da trè topi. I dati sò espressi cum'è media ± SEM; * P <0,05; ** P <0,01; *** P <0,001. (J) Tracce rappresentative di AP spontanea registrate utilizendu a modalità patch clamp perforata. Traccia superiore: Frequenza massima di AP. Traccia inferiore: zoom di un unicu AP. (K) Quantificà a frequenza media è massima di AP secondu (J). Test di Mann-Whitney; n = 5 cellule sò state analizzate da quattru topi. I dati sò espressi cum'è media ± SEM; micca impurtante.
Un dannu OXPHOS evidente hè statu rilevatu in u PN Mfn2cKO di 8 settimane, ciò chì indica chì a funzione fisiologica di i neuroni hè gravemente anormale. Dunque, avemu analizatu e caratteristiche elettriche passive di i neuroni deficienti di OXPHOS à 4 à 5 settimane è à 7 à 8 settimane realizendu registrazioni di patch clamp di cellule intere in fette cerebellari acute (Figura 2E). Inaspettatamente, u putenziale mediu di membrana à riposu è a resistenza d'ingressu di i neuroni Mfn2cKO eranu simili à u cuntrollu, ancu s'ellu ci eranu differenze suttili trà e cellule (Tabella 1). Similmente, à 4 à 5 settimane d'età, ùn sò stati trovati cambiamenti significativi in ​​a relazione corrente-tensione (curva IV) (Figura 2F). Tuttavia, nisun neurone Mfn2cKO di 7 à 8 settimane hà sopravvissutu à u regime IV (passu d'iperpolarizazione), ciò chì indica chì ci hè una chiara sensibilità à u putenziale d'iperpolarizazione in questa fase tardiva. In cuntrastu, in i neuroni Mfn2cKO, e currenti depolarizzanti chì causanu scariche di putenziali d'azione ripetitive (AP) sò ben tollerate, ciò chì indica chì i so mudelli generali di scarica ùn sò micca significativamente diffirenti da quelli di i neuroni di cuntrollu di 8 settimane (Tavula 1 è Figura 2G). In listessu modu, a frequenza è l'ampiezza di e currenti postsinaptiche spontanee (sPSC) eranu paragunabili à quelle di u gruppu di cuntrollu, è a frequenza di l'eventi hè aumentata da 4 settimane à 5 settimane à 7 settimane à 8 settimane cù un aumentu simile (Figura 2, H è I). U periodu di maturazione sinaptica in PN (25). Risultati simili sò stati ottenuti dopu à patch perforati di PN. Questa cunfigurazione impedisce a pussibile compensazione di difetti cellulari di ATP, cum'è puderia accade in a registrazione di patch clamp di cellule intere. In particulare, u putenziale di membrana à riposu è a frequenza di scarica spontanea di i neuroni Mfn2cKO ùn sò stati affettati (Figura 2, J è K). In riassuntu, sti risultati indicanu chì i PN cù una disfunzione OXPHOS evidente ponu fà fronte bè à i mudelli di scarica d'alta frequenza, ciò chì indica chì ci hè un mecanismu di compensazione chì li permette di mantene risposte elettrofisiologiche quasi nurmali.
I dati sò espressi cum'è media ± SEM (analisi di varianza à una via, test di paragone multiplu di Holm-Sidak; *P<0,05). U numeru di l'unità hè indicatu da parentesi.
Avemu decisu d'investigà se una categuria in u dataset di proteomica (Figura 1G) include percorsi chì ponu cuntrastà a carenza severa d'OXPHOS, spiegendu cusì perchè a PN affetta pò mantene un'elettrofisiologia quasi nurmale (Figura 2, da E à K). L'analisi proteomica hà dimustratu chì l'enzimi implicati in u catabolismu di l'aminoacidi à catena ramificata (BCAA) eranu significativamente sovraregulati (Figura 3A è Figura S5A), è u pruduttu finale acetil-CoA (CoA) o succinil CoA ponu supplementà i tricarbossilati in u ciclu di l'acidu di l'arteriosclerosi (TCA). Avemu trovu chì u cuntenutu di BCAA transaminasi 1 (BCAT1) è BCAT2 hè aumentatu. Catalizanu u primu passu di u catabolismu BCAA generendu glutamatu da α-chetoglutaratu (26). Tutte e subunità chì custituiscenu u cumplessu di chetoacidi deidrogenasi à catena ramificata (BCKD) sò sovraregulate (u cumplessu catalizeghja a decarbossilazione successiva è irreversibile di u scheletru di carbone BCAA risultante) (Figura 3A è Figura S5A). Tuttavia, ùn sò stati trovati cambiamenti evidenti in u BCAA stessu in u PN urdinatu, chì pò esse duvutu à l'aumentu di l'assorbimentu cellulare di questi aminoacidi essenziali o à l'usu di altre fonti (glucosiu o acidu latticu) per supplementà u ciclu TCA (Figura S5B). I PN chì mancanu di OXPHOS anu ancu mostratu una maggiore attività di decomposizione è transaminazione di a glutammina à 8 settimane di età, chì pò esse riflessa da a sovraregulazione di l'enzimi mitocondriali glutaminasi (GLS) è glutamina piruvato transaminasi 2 (GPT2) (Figura 3, A è C). Hè da nutà chì a sovra-regulazione di GLS hè limitata à l'isoforma splicing glutaminasi C (GLS-GAC) (u cambiamentu di Mfn2cKO/CTRL hè circa 4,5 volte, P = 0,05), è a so sovra-regulazione specifica in i tessuti cancerosi pò sustene a bioenergia mitocondriale. (27).
(A) A mappa di calore mostra u cambiamentu di u livellu di proteine ​​per a via specificata à 8 settimane. (B) Esempiu di una fetta cerebellare marcata cù anticorpu anti-PCx (barra di scala, 20 μm). A freccia gialla indica u corpu cellulare di Purkinje. (C) Analisi di l'espressione di e proteine ​​in u corsu di u tempu identificata cum'è un candidatu impurtante per l'aterosclerosi (test t multiplu, *FDR <5%; n = 3-5 topi). (D) Sopra: Un diagramma schematicu chì mostra i diversi modi di entre in u carbone marcatu cuntenutu in u tracciante [1-13C]piruvatu (vale à dì, via PDH o via trans-arteriale). Sottu: U graficu di viulinu mostra a percentuale di carbone marcatu solu (M1) cunvertitu in acidu asparticu, acidu citricu è acidu malicu dopu avè marcatu e fette cerebellari acute cù [1-13C]piruvatu (test t appaiatu; ** P <0,01). (E) Analisi cumpleta di a storia di u tempu di u percorsu indicatu. Cunsiderate solu e proteine ​​cù P <0,05 à 8 settimane. Linea tratteggiata: nisun valore di aghjustamentu (analisi di varianza à duie vie; * P <0,05; *** P <0,001). I dati sò espressi cum'è media ± SEM.
In a nostra analisi, u catabolismu di i BCAA hè diventatu una di e vie chjave di sovra-regulazione. Questu fattu suggerisce fortemente chì u vulume di ventilazione chì entra in u ciclu TCA pò esse cambiatu in PN senza OXPHOS. Questu pò rapprisintà una forma maiò di ricablaggio metabolicu neuronale, chì pò avè un impattu direttu nantu à a fisiologia neuronale è a sopravvivenza durante u mantenimentu di una disfunzione OXPHOS severa. In cunfurmità cù sta ipotesi, avemu trovu chì u principale enzima anti-ateroscleroticu PCx hè sovra-regulatu (Mfn2cKO/CTRL cambia circa 1,5 volte; Figura 3A), chì catalizeghja a cunversione di piruvatu in ossalacetatu (28), chì si crede esse in u tissutu cerebrale. L'espressione in hè limitata à l'astrociti (29, 30). In cunfurmità cù i risultati proteomichi, a microscopia cunfocale hà dimustratu chì l'espressione di PCx era specificamente è significativamente aumentata in PN cù deficit di OXPHOS, mentre chì a reattività di PCx era principalmente limitata à e cellule gliali di Bergmann adiacenti di u cuntrollu (Figura 3B). Per testà funziunalmente a sovraespressione osservata di PCx, avemu trattatu fette cerebellari acute cù u tracciante [1-13C]piruvatu. Quandu u piruvatu hè statu ossidatu da a piruvatu deidrogenasi (PDH), a so etichetta isotopica hè sparita, ma hè incorporata in l'intermedi di u ciclu TCA quandu u piruvatu hè metabolizatu da reazioni vasculari (Figura 3D). À sustegnu di i nostri dati proteomichi, avemu osservatu un gran numeru di marcatori da questu tracciante in l'acidu asparticu di e fette Mfn2cKO, mentre chì l'acidu citricu è l'acidu malicu anu ancu avutu una tendenza muderata, ancu s'ella ùn hè micca significativa (Figura 3D).
In i neuroni dopaminergici di i topi MitoPark cù disfunzione mitocondriale causata da neuroni dopaminergici chì distrughjenu specificamente u genu di u fattore di trascrizione mitocondriale A (Tfam) (Figura S6B), l'espressione di PCx era ancu significativamente sovraregulata (31), chì indica chì l'arteriosclerosi di l'acidu acetonicu L'occorrenza di a malatia hè regulata durante a disfunzione di l'OXPHOS neuronale in u corpu. Vale a pena nutà chì hè statu trovu chì enzimi unichi (32-34) chì ponu esse espressi in neuroni chì ponu esse assuciati à l'arteriosclerosi sò significativamente sovraregulati in PN chì mancanu di OXPHOS, cum'è a propionil-CoA carbossilasi (PCC-A), u Malonil-CoA cunverte u propionil-CoA in succinil-CoA è l'enzima malicu mitocondriale 3 (ME3), chì u so rolu principale hè di recuperà u piruvatu da u malatu (Figura 3, A è C) (33, 35). Inoltre, avemu trovu un aumentu significativu di l'enzima Pdk3, chì fosforila è dunque inattiva a PDH (36), mentre chì ùn sò stati rilevati cambiamenti in l'enzima Pdp1 chì attiva a PDH o in u cumplessu enzimaticu PDH stessu (Figura 3A). In modu consistente, in i PN Mern2cKO, a fosforilazione di a subunità α1 α (PDHE1α) di u cumpunente E1 di a piruvato deidrogenasi di u cumplessu PDH in Ser293 (cunnisciutu per inibisce l'attività enzimatica di a PDH) hè stata aumentata (Figura S6C) (Figura S6C). U piruvato ùn hà accessu vasculare.
Infine, avemu trovu chì a super via di a biosintesi di serina è glicina, u ciclu di u folatu mitocondriale (1C) correlato è a biosintesi di a prolina (Figura 1G è Figura S5C) sò tutti significativamente sovraregulati, secondu i rapporti, durante u prucessu di attivazione. I tessuti circundanti sò attivati ​​​​cù disfunzione mitocondriale (5-7). L'analisi cunfocale chì sustene questi dati proteomichi hà dimustratu chì in PN cù OXPHOS mancante, e fette cerebellari di topi di 8 settimane sò state sottumesse à serina idrossimetiltransferasi 2 (SHMT2), un enzima chjave di u ciclu di u folatu mitocondriale. Risposta immune significativa (Figura S5D). In 13 fette cerebellari acute incubate cù CU-glucosio, l'esperimenti di tracciamentu metabolicu anu cunfirmatu ulteriormente a sovraregulazione di a biosintesi di serina è prolina, indicendu chì u flussu di isoforme di carbonu in serina è prolina hè aumentatu (Figura S5E). Siccomu e reazzioni prumosse da GLS è GPT2 sò rispunsevuli di a sintesi di glutamatu da a glutammina è di a transaminazione trà glutamatu è α-chetoglutaratu, a so sovra-regulazione indica chì i neuroni deficienti di OXPHOS anu una dumanda aumentata di glutamatu, questu puderia esse destinatu à mantene a biosintesi aumentata di prolina (Figura S5C). In cuntrastu cù questi cambiamenti, un'analisi proteomica di astrociti cerebellari di topi Mfn2cKO specifichi di PN hà dimustratu chì queste vie (cumprese tutte l'antiperossidasi) ùn anu micca cambiatu significativamente in espressione, dimustrendu cusì chì sta redirezzione metabolica hè selettiva per a PN degradata (Fig. S6, D à G).
In riassuntu, queste analisi anu rivelatu mudelli significativamente diversi di attivazione temporale di vie metaboliche specifiche in i PN. Benchì una funzione mitocondriale neuronale anormale pò purtà à l'aterosclerosi precoce è à u rimodellamentu 1C (Figura 3E è Figura S5C), è ancu cambiamenti prevedibili in l'espressione di i complessi I è IV, i cambiamenti in a sintesi de novo di a serina sò solu evidenti solu in e fasi tardive. Disfunzione OXPHOS (Figura 3E è Figura S5C). Queste scuperte definiscenu un prucessu sequenziale in u quale a risposta mitocondriale (ciclu 1C) è citoplasmatica (biosintesi di a serina) indotta da u stress rispondenu sinergisticamente cù l'aumentu di l'aterosclerosi in u ciclu TCA per rimodellà u metabolismu neuronale.
I PN di 8 settimane cù deficit d'OXPHOS ponu mantene l'attività d'eccitazione à alta frequenza è subisce una ricunnessione metabolica significativa per cumpensà a disfunzione mitocondriale. Sta scuperta suscita una pussibilità interessante chì ancu in questu mumentu, ste cellule possinu ancu riceve un interventu terapeuticu per ritardà o prevene a neurodegenerazione tardiva. Avemu risoltu sta pussibilità attraversu dui interventi indipendenti. In u primu metudu, avemu cuncipitu un vettore di virus adeno-associatu (AAV) dipendente da Cre in modu chì MFN2 pò esse espressu selettivamente in PN cù deficit d'OXPHOS in vivo (Figura S7A). L'AAV chì codifica MFN2 è u genu reporter fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) sò stati verificati in culture di neuroni primari in vitro, ciò chì hà causatu l'espressione di MFN2 in modu dipendente da Cre è hà salvatu a morfologia mitocondriale, impedendu cusì a neuromutazione in i neuroni Mfn2cKO (Figura S7, B, D è E). Dopu, avemu realizatu esperimenti in vivo per furnisce stereotassicamente Mfn2-AAV di 8 settimane à a corteccia cerebellare di topi Mfn2cKO è di cuntrollu, è avemu analizatu topi di 12 settimane (Figura 4A). I ​​topi Mfn2cKO trattati sò morti (Figura 1, A è B) (16). A trasduzione virale in vivo hà risultatu in l'espressione selettiva di PN in certi cerchi cerebellari (Figura S7, G è H). L'iniezione di l'AAV di cuntrollu chì esprime solu mCherry (Ctrl-AAV) ùn hà avutu alcun effettu significativu nantu à u gradu di neurodegenerazione in l'animali Mfn2cKO. In cuntrastu, l'analisi di Mfn2cKO trasdotti cù Mfn2-AAV hà mostratu un effettu protettivu significativu di u stratu cellulare PN (Figura 4, B è C). In particulare, a densità di i neuroni pare esse guasi indistinguibile da l'animali di cuntrollu (Figura 4, B è C, è Figura S7, H è I). L'espressione di MFN1 ma micca di MFN2 hè ugualmente efficace per salvà a morte neuronale (Figura 4C è Figura S7, C è F), ciò chì indica chì l'espressione di MFN1 ectopicu pò supplementà efficacemente a mancanza di MFN2. Ulteriori analisi à u livellu di una sola PN anu dimustratu chì Mfn2-AAV hà largamente salvatu l'ultrastruttura di i mitocondri, hà nurmalizatu i livelli di mtDNA è hà invertitu l'alta espressione di u marcatore anti-angiogenesi PCx ​​(Figura 4, C à E). L'ispezione visuale di i topi Mfn2cKO salvati in un statu di riposu hà dimustratu chì a so postura è i sintomi motori (muvimentu S1 à S3) eranu migliurati. In conclusione, questi esperimenti mostranu chì a reintroduzione ritardata di MFN2 in PN gravemente carenti di OXPHOS hè sufficiente per invertire u cunsumu di mtDNA è induce l'aterosclerosi, impedendu cusì a degenerazione di l'assoni è a morte neuronale in vivo.
(A) Un schema chì mostra u calendariu sperimentale per l'iniezione di AAV chì codifica MFN2 quandu a via metabolica indicata hè attivata. (B) Immagini confocali rappresentative di fette cerebellari di 12 settimane trasdotte à 8 settimane in topi Mfn2cKO è marcate cù anticorpi anti-Calbindina. Diritta: Scalatura di e fibre assonali. A scala di u zoom assonale hè 450 è 75 μm. (C) Sinistra: Quantificazione di a densità cellulare di Purkinje in u loop di trasduzione AAV (AAV+) (analisi di varianza unidirezionale; n = 3 topi). Diritta: analisi di focus di mtDNA in PN trasdotta à a settimana 12 (test t non appaiato; n = 6 cellule da trè topi). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrografie elettroniche di trasmissione rappresentative di PN di sezioni cerebellari Mfn2cKO trasdotte cù i vettori virali indicati. A maschera rosa illustra l'area occupata da i dendriti, è u quadratu giallu punteggiatu illustra u zoom furnitu à diritta; n rapprisenta u nucleu. Barra di scala, 1 μm. (E) mostra un esempiu di culurazione PCx in PN trasdottu à 12 settimane. Barra di scala, 20 μm. OE, sovraespressione; FC, cambiamentu di piega.
Infine, avemu investigatu l'impurtanza di a sopravvivenza cellulare indotta da a perossidasi in i PN chì anu sperimentatu una disfunzione OXPHOS. Avemu generatu mCherry chì codifica AAV-shRNA (RNA à forcina corta) chì mira specificamente à l'mRNA di PCx di u topu (AAV-shPCx), è avemu iniettatu u virus o u so cuntrollu scrambled (AAV-scr) in u cervellettu di i topi Mfn2cKO. L'iniezione hè stata effettuata à a quarta settimana di età (Figura 5A) per ottene una soppressione efficace di PCx durante u periodu in cui l'espressione di PCx aumentava (Figura 3C) è u stratu cellulare PN era sempre intattu (Figura 1A). Hè da nutà chì a soppressione di PCx (Figura S8A) porta à una accelerazione significativa di a morte di PN, chì hè limitata à l'anellu infettatu (Figura 5, B è C). Per capisce u mecanismu di l'effetti metabolichi indutti da a sovraregulazione di PCx, avemu studiatu u statu redox di e PN dopu à l'inattivazione di PCx è u biosensore otticu mediatu da AAV Grx1-roGFP2 sò stati espressi simultaneamente (Figura S8, da B à D) per valutà u cambiamentu relativu di u putenziale redox di u peptide (38). Dopu, avemu realizatu una microscopia d'imaghjini à fluorescenza à dui fotoni (FLIM) in fette di cervellu acute di Mfn2cKO di 7 settimane o di cumpagni di littera di cuntrollu per rilevà potenziali cambiamenti in u statu redox citoplasmaticu dopu avè verificatu e cundizioni FLIM (Figura S8, da E à G). L'analisi hà mostratu un aumentu significativu di u statu d'ossidazione di una sola PN Mfn2cKO chì manca l'espressione di PCx, chì hè diversa da i neuroni di cuntrollu o da e PN Mfn2cKO chì esprimenu solu shRNA scrambled (Figura 5, D è E). Quandu l'espressione di PCx hè stata regulata in calata, a percentuale di PN Mfn2cKO chì mostranu un statu altamente ossidatu hè aumentata di più di trè volte (Figura 5E), ciò chì indica chì a sovra-regulazione di PCx hà mantenutu a capacità redox di i neuroni degenerati.
(A) Un schema chì mostra u calendariu sperimentale per l'iniezione di AAV chì codifica shPCx quandu a via metabolica indicata hè attivata. (B) Fotografie confocali rappresentative di sezioni cerebellari di 8 settimane in topi Mfn2cKO trasdotti è marcati cù anticorpi anti-calcineurina à 4 settimane. Barra di scala, 450 μm. (C) Quantificazione di a densità cellulare di Purkinje in loop trasdotti da AAV (analisi di varianza unidirezionale; n = 3 à 4 topi). I dati sò espressi cum'è media ± SEM; *** P <0,001. (D) L'immagine FLIM rappresentativa mostra a durata di vita media di u sensore redox di glutatione chì esprime PN di 7 settimane in e cundizioni sperimentali specificate. Rapportu LUT (tabella di ricerca): intervallu di tempu di sopravvivenza (in picosecondi). Barra di scala, 25 μm. (E) L'istogramma mostra a distribuzione di i valori di durata di Grx1-roGFP2 da (D) (n = 158 à 368 cellule in dui topi sottu ogni cundizione). U graficu à torta sopra ogni istogramma: mostra u numeru di cellule cù valori di durata di vita significativamente più longhi (rossi, ossidati) o più corti (blu, ridotti), chì superanu 1 SD di u valore mediu di durata di vita in CTRL-AAV-scr. (F) U mudellu prupostu mostra l'effettu protettivu di a sovraregulazione di PCx neuronale.
In tuttu, i dati chì furnimu quì mostranu chì a riespressione di MFN2 pò salvà cumpletamente a PN avanzata cù una grave carenza di OXPHOS, una grave deplezione di mtDNA è una morfologia estremamente anormale simile à ista, furnendu cusì un prugressu cuntinuu ancu in e malatie avanzate. A neurodegenerazione furnisce evidenza reversibile di u stadiu prima di a morte cellulare. Stu gradu di flessibilità metabolica hè ulteriormente enfatizatu da a capacità di i neuroni di induce l'aterosclerosi (un ricablaggio di u ciclu TCA), chì inibisce l'espressione di PCx in PN chì mancanu di OXPHOS è aumenta a morte cellulare, ghjucendu cusì un rolu protettivu (Figura 5F).
In questu studiu, avemu furnitu evidenze chì a risposta di i PN à a disfunzione OXPHOS hè di cunverge gradualmente à l'aterosclerosi di u ciclu TCA attraversu a via di attivazione differenziale attivata da i prugrammi metabolichi. Avemu cunfirmatu l'analisi proteomica cù parechji metudi cumplementari è avemu rivelatu chì quandu sò sfidati da una disfunzione mitocondriale severa, i neuroni anu una forma prima scunnisciuta di elasticità metabolica. À a nostra surpresa, tuttu u prucessu di ricablaggio ùn marca micca necessariamente u statu metabolicu terminale chì accumpagna a neurodegenerazione gradualmente è irreversibilmente, ma i nostri dati suggerenu chì pò custituisce un neurone di mantenimentu ancu in a fase prima di a morte cellulare. Questa scuperta indica chì i neuroni anu un gradu considerableu di plasticità metabolica in u corpu. Questu fattu prova chì a reintroduzione successiva di MFN2 pò inverte l'espressione di i principali marcatori metabolichi è prevene a degenerazione di PN. À u cuntrariu, inibisce l'aterosclerosi è accelera i nervi transessuali.
Una di e scuperte più affascinanti di a nostra ricerca hè chì i PN chì mancanu d'OXPHOS ponu mudificà u metabolismu di u ciclu TCA aumentendu l'enzimi chì stimulanu specificamente l'arteriosclerosi. U riarrangiamentu metabolicu hè una caratteristica cumuna di e cellule cancerose, alcune di e quali si basanu nantu à a glutammina per supplementà l'intermedi di u ciclu TCA per pruduce equivalenti riduttori, chì guidanu a catena respiratoria è mantenenu a produzzione di precursori di biosintesi di lipidi è nucleotidi (39, 40). Un studiu recente hà dimustratu chì in i tessuti periferichi chì sperimentanu disfunzioni OXPHOS, a ricunnessione di u metabolismu di a glutammina/glutamatu hè ancu una caratteristica prominente (5, 41), induve a direzzione di l'entrata di a glutammina in u ciclu TCA dipende da a gravità di a ferita OXPHOS (41). Tuttavia, ùn ci hè micca evidenza chjara di alcuna similitudine di a plasticità metabolica neuronale in u corpu è a so pussibile rilevanza in u cuntestu di a malattia. In un recente studiu in vitro, i neuroni corticali primari anu dimustratu di mobilizà i pools di glutamatu per a neurotrasmissione, prumove cusì u metabolismu ossidativu è l'aterosclerosi in cundizioni di stress metabolicu (42). Hè da nutà chì sottu à l'inibizione farmacologica di l'enzima succinatu deidrogenasi di u ciclu TCA, si crede chì a carbossilazione di u piruvatu mantene a sintesi di l'oxaloacetatu in i neuroni granulari cerebellari cultivati ​​(34). Tuttavia, a rilevanza fisiologica di sti meccanismi per u tissutu cerebrale (induve si crede chì l'aterosclerosi sia principalmente limitata à l'astrociti) hà sempre un significatu fisiologicu impurtante (43). In questu casu, i nostri dati mostranu chì i PN danneggiati da OXPHOS in u corpu ponu esse cambiati in degradazione di BCAA è carbossilazione di u piruvatu, chì sò e duie fonti principali di supplementazione di intermedi di u pool TCA. Ancu s'è u cuntributu putativu di u catabolismu BCAA à u metabolismu energeticu neuronale hè statu prupostu, in più di u rolu di u glutamatu è di u GABA per a neurotrasmissione (44), ùn ci hè ancu nisuna evidenza di sti meccanismi in vivo. Dunque, hè faciule speculà chì i PN disfunzionali ponu cumpensà automaticamente u cunsumu di intermedi TCA guidati da u prucessu di assimilazione aumentendu l'aterosclerosi. In particulare, a sovraregulazione di PCx pò esse necessaria per mantene una dumanda aumentata di acidu asparticu, chì hè suggerita in e cellule proliferanti cù disfunzione mitocondriale (45). Tuttavia, a nostra analisi metabolomica ùn hà rivelatu alcun cambiamentu significativu in u livellu di statu stazionariu di l'acidu asparticu in i PN Mfn2cKO (Figura S6A), chì presumibilmente riflette a diversa utilizzazione metabolica di l'acidu asparticu trà e cellule proliferanti è i neuroni post-mitotici. Ancu s'è u mecanismu esattu di a sovraregulazione di PCx in i neuroni disfunzionali in vivo ferma da caratterizà, avemu dimustratu chì sta risposta prematura ghjoca un rolu impurtante in u mantenimentu di u statu redox di i neuroni, chì hè statu dimustratu in esperimenti FLIM nantu à fette cerebellari. In particulare, impedisce à i PN di sovraregulà PCx pò purtà à un statu più ossidatu è accelerà a morte cellulare. L'attivazione di a degradazione di BCAA è a carbossilazione di u piruvatu ùn sò micca modi per caratterizà i tessuti periferichi di a disfunzione mitocondriale (7). Dunque, parenu esse una caratteristica prioritaria di i neuroni deficienti di OXPHOS, ancu s'ellu ùn hè micca l'unica caratteristica, chì hè impurtante per a neurodegenerazione. .
A malatia cerebellare hè un tipu eterogeneu di malatia neurodegenerativa chì si manifesta di solitu cum'è atassia è spessu dannighja e PN (46). Sta pupulazione di neuroni hè particularmente vulnerabile à a disfunzione mitocondriale perchè a so degenerazione selettiva in i topi hè sufficiente per riproduce parechji di i sintomi motori chì caratterizanu l'atassia spinocerebellare umana (16, 47, 48). Sicondu i rapporti, un mudellu di topo transgenicu cù un genu mutante hè assuciatu à l'atassia spinocerebellare umana è hà una disfunzione mitocondriale (49, 50), enfatizendu l'impurtanza di studià e cunsequenze di a carenza di OXPHOS in PNPH. Dunque, hè particularmente adattatu per isolà è studià efficacemente sta pupulazione di neuroni unica. Tuttavia, datu chì e PN sò assai sensibili à a pressione è rapprisentanu una bassa proporzione di tutta a pupulazione di cellule cerebellari, per parechji studii basati nantu à l'omica, a separazione selettiva di elle cum'è cellule intere hè sempre un aspettu difficiule. Ancu s'ellu hè guasi impussibile d'ottene una mancanza assoluta di contaminazione d'altri tipi di cellule (in particulare i tessuti adulti), avemu cumminatu una tappa di dissociazione efficace cù FACS per ottene un numeru sufficiente di neuroni viabili per l'analisi proteomica à valle, è avemu una cupertura proteica abbastanza alta (circa 3000 proteine) paragunata à u set di dati esistente di tuttu u cervellettu (51). Priservendu a viabilità di e cellule intere, u metudu chì furnimu quì ci permette micca solu di verificà i cambiamenti in e vie metaboliche in i mitocondri, ma ancu di verificà i cambiamenti in e so contraparti citoplasmatiche, ciò chì cumplementa l'usu di etichette di membrana mitocondriale per arricchisce u tipu di cellula. U novu metudu per u numeru di mitocondri in tessuti cumplessi (52, 53). U metudu chì descrivemu ùn hè micca solu ligatu à u studiu di e cellule di Purkinje, ma pò esse facilmente applicatu à qualsiasi tipu di cellula per affruntà i cambiamenti metabolichi in i cervelli malati, cumpresi altri mudelli di disfunzione mitocondriale.
Infine, avemu identificatu una finestra terapeutica durante questu prucessu di riarrangiamentu metabolicu chì pò inverte cumpletamente i segni chjave di u stress cellulare è prevene a degenerazione neuronale. Dunque, capisce l'implicazioni funziunali di u ricablaggio descrittu quì pò furnisce insights fundamentali nantu à i pussibuli trattamenti per mantene a viabilità neuronale durante a disfunzione mitocondriale. A ricerca futura destinata à dissezionà i cambiamenti in u metabolismu energeticu in altri tipi di cellule cerebrali hè necessaria per rivelà cumpletamente l'applicabilità di questu principiu à altre malatie neurologiche.
I topi MitoPark sò stati descritti prima (31). I topi C57BL/6N cù i geni Mfn2 fiancheggianti loxP sò stati descritti prima (18) è incrociati cù topi L7-Cre (23). A progenie doppia eterozigota risultante hè stata poi incrociata cù topi omozigoti Mfn2loxP/Mfn2loxP per generà knockout di geni specifici di Purkinje per Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). In un sottoinsieme di accoppiamenti, l'allele Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) hè statu introduttu per mezu di incroci supplementari (20). Tutte e procedure animali sò state realizate in cunfurmità cù e linee guida europee, naziunali è istituzionali è appruvate da LandesamtfürNatur di Umwelt è Verbraucherschutz, Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania. U travagliu animale seguita ancu e linee guida di a Federazione Europea di l'Associazioni di Scienze Animali di Laboratoriu.
Dopu avè anestetizatu a dislocazione cervicale di a donna incinta, l'embrione di topo hè statu isolatu (E13). A corteccia hè stata dissezionata in a Soluzione Salina Equilibrata di Hanks (HBSS) supplementata cù 10 mM di Hepes è passata nantu à u Mediu di Eagle Modificatu di Dulbecco chì cuntene papaina (20 U/ml) è cisteina (1μg/ml). Incubà u tissutu in DMEM) è dissociallu per digestione enzimatica. Ml) à 37°C per 20 minuti, è dopu macinatu meccanicamente in DMEM supplementatu cù u 10% di serum fetale bovinu. E cellule sò state seminate nantu à vetrini rivestiti di polilisina à una densità di 2×106 per piastra di cultura di 6 cm o à una densità di 0,5×105 cellule/cm2 per l'analisi d'imaghjini. Dopu à 4 ore, u mezu hè statu rimpiazzatu cù un mezu senza serum Neurobasal chì cuntene 1% di supplementu B27 è 0,5 mM di GlutaMax. I neuroni sò stati mantenuti à 37°C è 5% di CO2 durante tuttu l'esperimentu, è alimentati una volta à settimana. Per induce a ricombinazione in vitro, 3 μl (piastra di cultura à 24 pozzetti) o 0,5 μl (piastra à 24 pozzetti) di u seguente vettore virale AAV9 hè statu utilizatu per trattà i neuroni u secondu ghjornu in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numeru di catalogu 105530-AAV9) è AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numeru di catalogu 105545-AAV9).
U DNA cumplementariu di topi Mfn1 è Mfn2 (ottenutu da u plasmid Addgene #23212 è #23213, rispettivamente) hè marcatu cù a sequenza V5 (GKPINPLLGLDST) à u C-terminale, è hè fusu cù mCherry in quadru attraversu a sequenza T2A. Grx1-roGFP2 hè un rigalu da Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Rimpiazzendu a cassetta tdTomato utilizendu metudi di clonazione cunvinziunali, a cassetta hè stata subclonata in u backbone pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numeru di riferimentu Addgene 28306) per generà i vettori pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 è pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Una strategia simile hè stata aduprata per generà u vettore di cuntrollu pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Per generà a custruzzione AAV-shPCx, hè necessariu un vettore AAV plasmidicu (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), chì cuntene a sequenza di DNA chì codifica u shRNA chì mira u PCx di u topu (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Sottu u cuntrollu di u promotore U6, mCherry hè adupratu sottu u cuntrollu di u promotore CMV. A pruduzzione di vettori AAV ausiliari hè stata realizata secondu l'istruzzioni di u fabricatore (Cell Biolabs). In breve, aduprate un plasmide di trasferimentu chì porta mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) Trasfezione transitoria di u genu codificante 293AAV cells-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), è ancu codificante a proteina di u capside AAV1 è u plasmide di imballaggio di a proteina accessoria, utilizendu u metudu di u fosfatu di calciu. U surnatante di u virus crudu hè statu ottenutu da cicli di congelazione-scongelamentu in un bagnu di ghiaccio secco/etanolo è cellule lisate in soluzione salina tamponata cù fosfatu (PBS). U vettore AAV hè statu purificatu per ultracentrifugazione discontinua in gradiente di iodixanol (24 ore à 32.000 rpm è 4°C) è cuncintratu cù un filtru centrifugu Amicon ultra-15. U titru genomicu di AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 copia di genomu (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX hè statu cum'è descrittu prima (54), misuratu per PCR quantitativa in tempu reale (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) è AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml).
I neuroni primari sò stati raschiati in PBS 1x ghiacciatu, pellettati, è dopu omogeneizzati in buffer di lisi 0,5% Triton X-100 / 0,5% deossicolatu di sodiu / PBS chì cuntene fosfatasi è inhibitore di proteasi (Roche). A quantificazione di e proteine ​​hè stata realizata utilizendu u test di l'acidu bicinconinicu (Thermo Fisher Scientific). E proteine ​​sò state dopu separate per elettroforesi in gel di SDS-poliacrilamide, è dopu trasferite nantu à una membrana di fluoruru di polivinilidene (GE Healthcare). Bluccà i siti non specifichi è incubate cù l'anticorpu primariu (vede a Tabella S1 per i dettagli) in latte à 5% in TBST (soluzione salina tamponata cù Tris cù Tween), passi di lavaggio è anticorpu secundariu in incubazione TBST. Incubà cù l'anticorpu primariu per una notte à +4°C. Dopu u lavaggio, applicà l'anticorpu secundariu per 2 ore à temperatura ambiente. Successivamente, incubando u listessu blot cù un anticorpu anti-β-actina, hè stata cunfirmata a stessa carica. Rilevazione per cunversione in chemiluminescenza è rinfurzamentu di a chemiluminescenza (GE Healthcare).
I neuroni precedentemente suminati nantu à i vetrini coprioggetto sò stati fissati cù 4% di paraformaldeide (PFA)/PBS à u puntu di tempu specificatu à temperatura ambiente per 10 minuti. I vetrini coprioggetto sò prima permeati cù 0,1% di Triton X-100/PBS per 5 minuti à temperatura ambiente, è dopu in buffer bloccante [3% di albumina di serum bovinu (BSA)/PBS]. U secondu ghjornu, i vetrini coprioggetto sò stati lavati cù buffer bloccante è incubati cù l'anticorpu secundariu cunjugatu cù fluoroforu adattatu per 2 ore à temperatura ambiente; infine, i campioni sò stati lavati accuratamente in PBS cù 4′,6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) hè controcoloratu è dopu fissatu nantu à u vetrino di microscopiu cù Aqua-Poly/Mount.
I topi (maschi è femine) sò stati anestetizzati per via intraperitoneale di ketamina (130 mg/kg) è xilazina (10 mg/kg) è amministrati per via sottocutanea cù analgesicu carprofene (5 mg/kg), è piazzati in un strumentu stereotassicu (Kopf) equipatu di un cuscinettu caldu. Espone u craniu è aduprate una fresa dentale per assottiglià a parte di a corteccia cerebellare currispondente à l'ossu mis (da lambda: coda 1.8, laterale 1, currispondente à i lobuli IV è V). Aduprate un ago di siringa curvu per creà cù cura un picculu foru in u craniu per evità di interrompe a vasculatura sottu. Dopu, u capillare di vetru sottile hè inseritu lentamente in u micro-foru (da -1.3 à -1 nantu à u latu ventrale di a dura madre), è da 200 à 300 nl di AAV sò iniettati in u micro-iniettore (Narishige) cù siringhe manuali (Narishige) parechje volte à bassa pressione per un periodu di tempu da 10 à 20 minuti. Dopu l'infusione, piazzate u capillare per altri 10 minuti per permette à u virus di sparghjesi cumpletamente. Dopu chì i capillari sò stati ritirati, a pelle hè suturata cù cura per minimizà l'inflammazione di a ferita è permette à l'animale di ricuperà. L'animali sò stati trattati cù analgesici (caspofen) per parechji ghjorni dopu l'operazione, durante i quali a so cundizione fisica hè stata attentamente monitorata è dopu sò stati eutanasizati à u puntu di tempu indicatu. Tutte e procedure sò state realizate in cunfurmità cù e linee guida europee, naziunali è istituziunali è sò state appruvate da LandesamtfürNatur di Umwelt è Verbraucherschutz, Renania Settentrionale-Vestfalia, Germania.
L'animali sò stati anestetizzati cù ketamina (100 mg/kg) è xilazina (10 mg/kg), è u core hè statu perfusu prima cù 0,1 M PBS, è dopu cù 4% PFA in PBS. U tissutu hè statu dissezionatu è fissatu in 4% PFA/PBS durante a notte à 4°C. Un cultellu vibrante (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) hè statu utilizatu per preparà sezioni sagittali (50 μm di spessore) da u cervellu fissatu in PBS. Salvu specificazione contraria, a culurazione di e sezioni in libera flottazione hè stata effettuata cum'è descrittu sopra (13) à temperatura ambiente è agitazione. In breve, prima, e fette ottenute sò state permeabilizzate cù 0,5% Triton X-100/PBS per 15 minuti à temperatura ambiente; per alcuni epitopi (Pcx è Shmt2), scaldendu e fette per 25 minuti invece di questu passu in tampone tris-EDTA à 80°C (PH 9). Dopu, e sezioni sò state incubate cù l'anticorpu primariu (vede a Tabella S1) in un buffer di bloccu (3% BSA/PBS) à 4°C per tutta a notte cù agitazione. U ghjornu dopu, e sezioni sò state lavate cù u buffer di bloccu è incubate cù l'anticorpu secundariu cunjugatu cù fluoroforu adattatu per 2 ore à temperatura ambiente; infine, e sezioni sò state lavate accuratamente in PBS, contracolorate cù DAPI, è poi fissate cù AquaPolymount nantu à un vetrino da microscopiu.
Un microscopiu cunfocale à scansione laser (TCS SP8-X o TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) equipatu cù un laser à luce bianca è un laser ultraviolettu à 405 diodi hè statu utilizatu per imaginà u campione. Eccitendu u fluoroforu è raccogliendu u signale cù u Detector Hybrid (HyDs), u software LAS-X hè statu utilizatu per raccoglie immagini impilate conformi à u campionamentu Nyquist in modu sequenziale: per i pannelli non quantitativi, si tratta di signali altamente dinamici (per esempiu, in cellule somatiche è dendriti) mtYFP) Aduprate HyD per rilevà u numeru di PN in modu BrightR). U gating da 0,3 à 6 ns hè applicatu per riduce u fondu.
Imaging in tempu reale di e cellule classificate. Dopu a classificazione in u mezu Neurobasal-A chì cuntene 1% di supplementu B27 è 0,5 mM di GlutaMax, e cellule sò state subitu seminate nantu à vetrini rivestiti di poli-l-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, numeru di catalogu 80826), è dopu mantenute à 37°C è 5% di CO2 per 1 ora per permette à e cellule di sedimentà. L'imaging in tempu reale hè statu realizatu nantu à un microscopiu cunfocale à scansione laser Leica SP8 equipatu cù un laser biancu, HyD, una lente obiettiva à oliu di 63×[apertura numerica 1,4 (NA)] è un stadiu di riscaldamentu.
U topu hè statu rapidamente anestetizatu cù diossidu di carbonu è decapitatu, u cervellu hè statu rapidamente eliminatu da u craniu, è tagliatu in sezioni sagittali di 200 μm di spessore (per l'esperimentu di marcatura 13C) o 275 μm di spessore (per esperimenti di dui fotoni) riempite cù i seguenti materiali. U ghjacciu (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) hè pienu di e seguenti sustanze: 125 mM di fluidu cerebrospinale artificiale (ACSF) à bassu cuntenutu di Ca2 + ghiacciatu, saturatu di carbonu (95% O2 è 5% CO2), 2,5 mM KCl, 1,25 mM di tampone fosfatu di sodiu, 25 mM NaHCO3, 25 mM di glucosiu, 0,5 mM CaCl2 è 3,5 mM MgCl2 (pressione osmotica da 310 à 330 mmol). Trasferite e fette di cervellu ottenute in una camera di pre-incubazione chì cuntene un mediu cù una concentrazione più alta di Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfatu di sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosiu, 1,0 mM CaCl2 è 2,0 mM MgCl2) pH 7,4 è da 310 à 320 mmol).
Durante u prucessu d'imaghjini, e fette sò state spostate in una stanza d'imaghjini dedicata, è l'esperimentu hè statu realizatu sottu perfusione cuntinua ACSF à una temperatura costante di 32° à 33°C. Un microscopiu à scansione laser multifotonica (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) equipatu cù una lente obiettiva Leica 25x (NA 0.95, acqua), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) hè statu utilizatu per l'imaghjini di e fette. Modulu FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM di Grx1-roGFP2. I cambiamenti in u statu redox citoplasmaticu di i PN sò stati misurati da FLIM à dui fotoni in fette sagittali di u cervellu, induve u biosensore Grx1-roGFP2 hà miratu i PN. In u stratu PN, u campu di acquisizione hè sceltu circa 50 à 80 μm sottu à a superficia di a fetta per assicurà chì ci sia un PN viabile (vale à dì, a mancanza di struttura perlata o cambiamenti morfologichi neuronali longu i dendriti) è u sensore roGFP2 doppiu pusitivu è AAV chì codifica shRNA PCx o a so sequenza di cuntrollu (ognuna coesprime mCherry). Raccoglie immagini à pila unica cù zoom digitale 2x [lunghezza d'onda di eccitazione: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Rilevazione: HyD internu, gruppu di filtri di isotiocianato di fluoresceina (FITC)] è media di l'immagine in 2 à 3 minuti sò aduprati per assicurà chì si raccolganu abbastanza fotoni (1000 fotoni in totale) per l'adattamentu di a curva. A sensibilità di a sonda Grx1-roGFP2 è a verificazione di e cundizioni FLIM sò state realizate monitorizendu u valore di a durata di vita di roGFP2 quandu si aghjusta 10 mM H2O2 esogenu à l'ACSF di perfusione (per massimizà l'ossidazione, risultendu in una durata di vita aumentata), è dopu aghjunghjendu 2 mM ditiotreitolo (minimizza u gradu di riduzione, risultendu in una diminuzione di a durata di vita) (Figura S8, da D à G). Aduprate u software FLIMfit 5.1.1 per analizà i risultati acquistati, adattà a curva di decadimentu esponenziale unica di tutta l'immagine à l'IRF misurata (funzione di risposta di u strumentu), è χ2 hè circa 1. Per calculà a durata di vita di una sola PN, a maschera intornu à u corpu nervosu hè stata disegnata manualmente, è a durata di vita media in ogni maschera hè stata aduprata per a quantificazione.
Analisi di u putenziale mitocondriale. Dopu chì a sezione acuta hè stata incubata cù 100 nM TMRM aghjuntu direttamente à l'ACSF perfusu per 30 minuti, i cambiamenti di u putenziale mitocondriale di e PN sò stati misurati da un microscopiu à dui fotoni. L'imaghjini TMRM hè stata realizata eccitendu a sonda à 920 nm è aduprendu HyD internu (isotiocianatu di tetrametilrodamina: 585/40 nm) per raccoglie i signali; aduprendu a stessa lunghezza d'onda d'eccitazione ma aduprendu un HyD internu differente (FITC: 525/50) per imaginà mtYFP. Aduprate u plug-in Image Calculator di ImageJ per valutà u putenziale mitocondriale à u livellu di a singola cellula. In breve, l'equazione di u plug-in: signal = min (mtYFP, TMRM) hè aduprata per identificà a regione mitocondriale chì mostra u signale TMRM in Purkinje Somali in l'imaghjini cunfocale à pila unica di u canale currispundente. Dopu, l'area di i pixel in a maschera risultante hè quantificata, è dopu nurmalizzata nantu à l'immagine à pila unica di soglia currispondente di u canale mtYFP per ottene a frazione mitocondriale chì mostra u putenziale mitocondriale.
L'imagine hè stata deconvoluta cù u software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Per l'imagine scansionate di e piastrelle, u montaggio di una sola piastrella hè fattu aduprendu l'algoritmu di cucitura automatica furnitu da u software LAS-X. Dopu a calibrazione di l'imagine, aduprate ImageJ è Adobe Photoshop per processà ulteriormente l'imagine è aghjustà uniformemente a luminosità è u cuntrastu. Aduprate Adobe Illustrator per a preparazione grafica.
Analisi di u focu di u mtDNA. U numeru di lesioni di u mtDNA hè statu quantificatu nantu à sezioni cerebellari marcate cù anticorpi contr'à u DNA per microscopiu cunfocale. Ogni zona bersagliu hè stata creata per u corpu cellulare è u nucleu di ogni cellula, è a zona rispettiva hè stata calculata cù u plug-in Multi Measure (software ImageJ). Sottrae l'area nucleare da l'area di u corpu cellulare per ottene l'area citoplasmatica. Infine, u plug-in Analyze Particles (software ImageJ) hè statu utilizatu per quantificà automaticamente i punti di DNA citoplasmaticu chì indicanu u mtDNA nantu à l'immagine di soglia, è i risultati ottenuti sò stati nurmalizati à a media PN di i topi CTRL. I risultati sò espressi cum'è u numeru mediu di nucleosidi per cellula.
Analisi di l'espressione di e proteine. Aduprate u plug-in Image Calculator di ImageJ per valutà l'espressione di e proteine ​​in PN à u livellu di una sola cellula. In breve, in l'immagine cunfocale à un solu stratu di u canale currispundente, per mezu di l'equazione: signal = min (mtYFP, anticorpu), a regione mitocondriale chì mostra immunoreattività à un certu anticorpu in Purkina hè identificata. Dopu, l'area di pixel in a maschera risultante hè quantificata, è dopu nurmalizzata nantu à l'immagine à pila unica di soglia currispundente di u canale mtYFP per ottene a frazione mitocondriale di a proteina visualizata.
Analisi di a densità di e cellule di Purkinje. U plugin Cell Counter di ImageJ hè statu utilizatu per valutà a densità di Purkinje dividendu u numeru di cellule di Purkinje cuntate per a lunghezza di l'anellu cerebellare occupatu da e cellule cuntate.
Preparazione è raccolta di campioni. I cervelli di u gruppu di cuntrollu è di i topi Mfn2cKO sò stati fissati in 2% PFA/2,5% glutaraldeide in tampone fosfatu 0,1 M (PB), è dopu e sezioni coronali sò state preparate aduprendu ciliati (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Spessore da 50 à 60 μm). Dopu fissate in tampone PB in 1% tetraossidu di os è 1,5% ferrocianuro di potassiu à temperatura ambiente per 1 ora. E sezioni sò state lavate trè volte cù acqua distillata, è dopu colorate cù 70% etanolu chì cuntene 1% acetatu di uranile per 20 minuti. E sezioni sò state dopu disidratate in alcolu graduatu è incluse in resina epossidica Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, numeru di catalogu 14040) trà vetrini rivestiti di silicone, è infine à 60°C polimerizate in fornu per 48 ore. L'area di a corteccia cerebellare hè stata selezziunata è sezioni ultrafini di 50 nm sò state tagliate nantu à Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) è prelevate nantu à una griglia di fessura di rame di 2 × 1 mm rivestita di film di polistirene. E sezioni sò state colorate cù una soluzione di acetato di uranile à 4% in H2O per 10 minuti, lavate cù H2O parechje volte, poi cù citratu di piombo Reynolds in H2O per 10 minuti, è poi lavate cù H2O parechje volte. E micrografie sò state scattate cù un microscopiu elettronicu à trasmissione Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) utilizendu una camera digitale TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Germania).
Per i topi infettati cù AAV, u cervellu hè statu siparatu è tagliatu in una sezione sagittale di 1 mm di spessore, è u cervellettu hè statu esaminatu cù un microscopiu à fluorescenza per identificà l'anellu infettatu da AAV (vale à dì, chì esprime mCherry). Solu l'esperimenti in i quali l'iniezione di AAV dà una efficienza di trasduzione assai alta di u stratu di cellule di Purkinje (vale à dì quasi tuttu u stratu) in almenu dui anelli cerebellari consecutivi sò aduprati. U loop trasdottu da AAV hè statu microdissezionatu per a post-fissazione durante a notte (4% PFA è 2,5% glutaraldeide in buffer cocoato 0,1 M) è ulteriormente processatu. Per l'inclusione di EPON, u tissutu fissatu hè statu lavatu cù buffer cocoato di sodiu 0,1 M (Applicihem), è incubatu cù 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) in buffer cocoato di sodiu 0,1 M (Applicihem) per 4 ore, poi lavato per 2 ore. Ripetere 3 volte cù buffer cocamide 0,1 M. In seguitu, a serie ascendente d'etanolu hè stata aduprata per incubà ogni suluzione d'etanolu à 4°C per 15 minuti per disidratà u tissutu. U tissutu hè statu trasferitu in ossidu di propilene è incubatu durante a notte in EPON (Sigma-Aldrich) à 4°C. Pone u tissutu in EPON frescu à temperatura ambiente per 2 ore, è poi incorporallu à 62°C per 72 ore. Aduprate un ultramicrotomu (Leica Microsystems, UC6) è un cultellu di diamante (Diatome, Biel, Svizzera) per taglià sezioni ultrasottili di 70 nm, è culurite cù 1,5% d'acetatu d'uranile per 15 minuti à 37°C, è culurite cù una suluzione di citratu di piombu per 4 minuti. E micrografie elettroniche sò state scattate aduprendu un microscopiu elettronicu à trasmissione JEM-2100 Plus (JEOL) equipatu cù Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) è u software DigitalMicrograph (Gatan). Per l'analisi, e micrografie elettroniche sò state acquistate cù un zoom digitale di 5000× o 10.000×.
Analisi morfologica di i mitocondri. Per tutte l'analisi, i contorni di i mitocondri individuali sò stati delineati manualmente in immagini digitali utilizendu u software ImageJ. Diversi parametri morfologici sò analizati. A densità mitocondriale hè espressa cum'è percentuale ottenuta dividendu l'area mitocondriale totale di ogni cellula per l'area di u citoplasma (area di u citoplasma = area cellulare - area di u nucleu cellulare) × 100. A rotondità di i mitocondri hè calculata cù a formula [4π∙(area/perimetru 2)]. A morfologia ista di i mitocondri hè stata analizata è divisa in duie categurie ("tubulare" è "blister") secondu e so forme principali.
Analisi di u numeru è di a densità di l'autofagosomi/lisosomi. Aduprate u software ImageJ per delineà manualmente i contorni di ogni autofagosomi/lisosomi in l'imagine digitale. L'area di l'autofagosomi/lisosomi hè espressa cum'è una percentuale calculata dividendu l'area tutale di a struttura di l'autofagosomi/lisosomi di ogni cellula per l'area di u citoplasma (area di u citoplasma = area cellulare - area di u nucleu) × 100. A densità di l'autofagosomi/lisosomi hè calculata dividendu u numeru tutale per u numeru di strutture di l'autofagosomi/lisosomi per cellula (in termini di area citoplasmatica) (area citoplasmatica = area cellulare - area nucleare).
Etichettatura per u sezionamentu acutu è a preparazione di u campione. Per l'esperimenti chì richiedenu l'etichettatura di u glucosiu, trasferisce e fette di cervellu acute in una camera di pre-incubazione, chì cuntene carbone saturatu (95% O2 è 5% CO2), ACSF à altu Ca2 + (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfatu di sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosiu, 1,0 mM CaCl2 è 2,0 mM MgCl2, aghjustatu à pH 7,4 è 310 à 320 mOsm), in u quale u glucosiu hè a sustituzione di glucosiu 13C6- (Eurisotop, numeru di catalogu CLM-1396). Per l'esperimenti chì necessitanu a marcatura cù piruvatu, trasferisce e sezioni di cervellu acute à un Ca2 + ACSF più altu (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfatu di sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosiu, 1,0 mM CaCl2 è aghjunghje 2,0 mM MgCl2, aghjustà à pH 7,4 è 310 à 320 mOsm), è aghjunghje 1 mM 1-[1-13C]piruvatu (Eurisotop, numeru di catalogu CLM-1082). Incubà e sezioni per 90 minuti à 37 °C. À a fine di l'esperimentu, e sezioni sò state lavate rapidamente cù una soluzione acquosa (pH 7,4) chì cuntene 75 mM di carbonatu d'ammoniu, è dopu omogeneizate in 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): metanolu: acqua. Dopu chì e sezioni sò state incubate nantu à u ghjacciu per 30 minuti, i campioni sò stati centrifugati à 21.000 g per 10 minuti à 4 °C, è u surnatante chjaru hè statu seccu in un concentratore SpeedVac. U pellet di metaboliti seccu risultante hè statu cunservatu à -80 °C finu à l'analisi.
Analisi di cromatografia liquida-spettrometria di massa di aminoacidi marcati cù 13 C. Per l'analisi di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS), u pellet di metabolitu hè statu risospesu in 75 μl d'acqua di qualità LC-MS (Honeywell). Dopu a centrifugazione à 21.000 g per 5 minuti à 4 °C, 20 μl di u surnatante chiarificatu sò stati utilizati per l'analisi di u flussu di aminoacidi, mentre chì u restu di l'estrattu hè statu immediatamente utilizatu per l'analisi di l'anioni (vede sottu). L'analisi di l'aminoacidi hè stata realizata utilizendu u protocolu di derivatizazione di u cloruru di benzoile descrittu prima (55, 56). In u primu passu, 10 μl di carbonatu di sodiu 100 mM (Sigma-Aldrich) sò stati aghjunti à 20 μl di estrattu di metabolitu, è dopu 10 μl di cloruru di benzoile à 2% (Sigma-Aldrich) sò stati aghjunti à l'ACN di qualità LC. U campione hè statu vortexatu brevemente è dopu centrifugatu à 21.000 g per 5 minuti à 20 ° C. Trasferite u surnatante purificatu in una fiala di autocampionatore di 2 ml cù un insertu di vetru cunicu (volume 200 μl). I campioni sò stati analizati utilizendu u sistema LC Acquity iClass ultra-high performance (Waters) cunnessu à u spettrometru di massa di precisione ad alta risoluzione Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Per l'analisi, 2 μl di u campione derivatizatu sò stati iniettati in una colonna di silice T3 ad alta resistenza di 100 × 1,0 mm (Waters) chì cuntene particelle di 1,8 μm. A velocità di flussu hè di 100 μl / min, è u sistema tampone hè custituitu da u tampone A (10 mM di formiatu d'ammoniu è 0,15% d'acidu formicu in acqua) è u tampone B (ACN). U gradiente hè u seguente: 0% B à 0 minuti; 0% B. 0 à 15% B da 0 à 0,1 minuti; 15 à 17% B da 0,1 à 0,5 minuti; B da 17 à 55% da 0,5 à 14 minuti; B da 55 à 70% da 14 à 14,5 minuti; da 14,5 à 70 à 100% B da 18 minuti; 100% B da 18 à 19 minuti; 100 à 0% B da 19 à 19,1 minuti; 0% B da 19,1 à 28 minuti (55, 56). U spettrometru di massa QE-HF funziona in modu di ionizazione pusitiva cù una gamma di massa di m/z (rapportu massa/carica) da 50 à 750. A risoluzione applicata hè 60.000, è u bersagliu di ionizazione di cuntrollu di guadagnu (AGC) ottenutu hè 3 × 106, è u tempu massimu di ionizazione hè 100 millisecondi. A fonte di ionizazione elettrospray riscaldata (ESI) funziona à una tensione di spruzzatura di 3,5 kV, una temperatura capillare di 250 °C, un flussu d'aria di guaina di 60 AU (unità arbitrarie) è un flussu d'aria ausiliariu di 20 AU. 250 °C. A lente S hè impostata à 60 AU.
Analisi di cromatografia anionica-MS di acidi organici marcati cù 13C. U precipitatu di metabolitu restante (55 μl) hè statu analizatu cù un sistema di cromatografia ionica Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) cunnessu à un spettrometru di massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). In breve, 5 μl di estrattu di metabolitu sò stati iniettati in una colonna Dionex IonPac AS11-HC equipata cù HPLC (2 mm × 250 mm, dimensione di e particelle 4 μm, Thermo Fisher Scientific) in modalità di loop parziale push-in cù un rapportu di riempimentu di 1.) Colonna di guardia Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). A temperatura di a colonna hè mantenuta à 30 °C, è l'autocampionatore hè impostatu à 6 °C. Aduprate una cartuccia di idrossidu di potassiu furnita cù acqua deionizzata per generà un gradiente di idrossidu di potassiu attraversu u generatore di eluente. Separazione di i metaboliti à un flussu di 380 μl/min, applicendu u seguente gradiente: da 0 à 3 minuti, 10 mM KOH; da 3 à 12 minuti, da 10 à 50 mM KOH; da 12 à 19 minuti, da 50 à 100 mM KOH; da 19 à 21 minuti, 100 mM KOH; da 21 à 21,5 minuti, da 100 à 10 mM KOH. A colonna hè stata riequilibrata sottu à 10 mM KOH per 8,5 minuti.
I metaboliti eluiti sò cumminati cù un flussu di supplementu d'isopropanolu di 150 μl/min dopu à a colonna è dopu diretti à un spettrometru di massa à alta risoluzione chì funziona in modu di ionizazione negativa. MS monitorizza l'intervallu di massa da m/z 50 à 750 cù una risoluzione di 60.000. L'AGC hè impostu à 1 × 106, è u tempu massimu di ioni hè mantinutu à 100 ms. A fonte ESI riscaldata hè stata operata à una tensione di spruzzatura di 3,5 kV. L'altri paràmetri di a fonte di ioni sò i seguenti: temperatura capillare 275 ° C; flussu di gas di guaina, 60 AU; flussu di gas ausiliariu, 20 AU à 300 ° C, è impostazione di a lente S à 60 AU.
Analisi di dati di metaboliti marcati cù 13C. Aduprate u software TraceFinder (versione 4.2, Thermo Fisher Scientific) per l'analisi di dati di u rapportu isotopicu. L'identità di ogni cumpostu hè stata verificata da un cumpostu di riferimentu affidabile è analizata indipindentamente. Per realizà l'analisi di l'arricchimentu isotopicu, l'area di u cromatogramma ionicu estrattu (XIC) di ogni isotopu 13C (Mn) hè stata estratta da [M + H] +, induve n hè u numeru di carbone di u cumpostu target, utilizatu per analizà l'aminoacidi o [MH] + hè utilizatu per analizà l'anioni. A precisione di massa di XIC hè inferiore à cinque parti per milione, è a precisione di RT hè di 0,05 minuti. L'analisi di l'arricchimentu hè realizata calculendu u rapportu di ogni isotopu rilevatu à a somma di tutti l'isotopi di u cumpostu currispundente. Questi rapporti sò dati cum'è valori percentuali per ogni isotopu, è i risultati sò espressi cum'è arricchimentu percentuale molare (MPE), cum'è descrittu prima (42).
U pellet di neuroni congelatu hè statu omogeneizatu in metanolu 80% (v/v) fretu cum'è ghiaccio, vortexatu è incubatu à -20 °C per 30 minuti. Vortexate di novu u campione è mescolate à +4 °C per 30 minuti. U campione hè statu centrifugatu à 21.000 g per 5 minuti à 4 °C, è dopu u surnatante risultante hè statu raccoltu è seccu cù un concentratore SpeedVac à 25 °C per l'analisi successiva. Cum'è descrittu sopra, l'analisi LC-MS hè stata realizata nantu à l'aminoacidi di e cellule ordinate. Usendu TraceFinder (versione 4.2, Thermo Fisher Scientific), l'analisi di i dati hè stata realizata utilizendu a massa monoisotopica di ogni compostu. A nurmalizazione quantile di i dati di i metaboliti hè stata realizata utilizendu u pacchettu software preprocessCore (57).
Preparazione di e fette. U topu hè statu anestetizatu rapidamente cù diossidu di carbonu è decapitatu, u cervellu hè statu rapidamente eliminatu da u craniu, è u cultellu vibrante pienu di ghiaccio (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germania) hè statu utilizatu per tagliallu in sezioni sagittali da 300 à 375 μm. Gassificazione à carbone fretu (95% O2 è 5% CO2). Bassu Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfatu di sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosiu, 1,0 mM CaCl2 è 6,0 mM MgCl2. Ajustà à pH 7,4 è da 310 à 330 mOsm). Trasferisce e fette di cervellu ottenute in una camera chì cuntene Ca2 + ACSF più altu (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampone fosfatu di sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosiu, 4,0 mM CaCl2 è mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 è 310 à 320 mOsm). Conservate e fette per 20 à 30 minuti in modu chì possinu esse restaurate prima di a registrazione.
registrazione. Un tavulinu di microscopiu equipatu cù una camera di registrazione fissa è una lente obiettiva à immersione in acqua 20x (Scientifica) hè statu utilizatu per tutte e registrazioni. E presunte cellule di Purkinje sò state identificate da (i) a dimensione di u corpu, (ii) a situazione anatomica di u cervellettu, è (iii) l'espressione di u genu reporter fluorescente mtYFP. A pipetta di patch cù una resistenza di punta da 5 à 11 megaohm hè tirata fora da un capillare di vetru borosilicatu (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Germania) è una pipetta orizzontale Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Tutte e registrazioni sò state effettuate da l'amplificatore a pinza di patch npi ELC-03XS (npi electronic GmbH, Tam, Germania), chì era cuntrullatu da u software Signal (versione 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). L'esperimentu hè statu registratu à una frequenza di campionamentu di 12,5 kHz. U signale hè filtratu cù dui filtri Bessel à passaghju cortu cù frequenze di taglio di 1,3 è 10 kHz rispettivamente. A capacità di a membrana è di a pipetta hè compensata da u circuitu di compensazione utilizendu l'amplificatore. Tutti l'esperimenti sò stati realizati sottu u cuntrollu di una camera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germania), chì era cuntrullata da u software Hokawo (versione 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germania).
Cunfigurazione è analisi di rutina di e cellule intere. Subitu prima di a registrazione, riempite a pipetta cù a suluzione interna chì cuntene e seguenti sustanze: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconatu di potassiu, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM Guanosina trifosfatu (GTP) (Na) è 10,0 mM creatinina fosfatu sò stati aghjustati à pH 7,25, è a pressione osmotica era 290 mOsm (saccarosiu). Subitu dopu avè applicatu una forza di 0 pA per rompe a membrana, hè statu misuratu u putenziale di membrana à riposu. A resistenza d'ingressu hè misurata applicendu currenti iperpolarizate di -40, -30, -20 è -10 pA. Misurate a magnitudine di a risposta à a tensione è aduprate a lege di Ohm per calculà a resistenza d'ingressu. L'attività spontanea hè stata registrata in una pinza di tensione per 5 minuti, è a sPSC hè stata identificata è misurata in Igor Pro (versione 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) utilizendu un script di ricunniscenza semi-automatica. A curva IV è a corrente à statu stazionariu sò misurate chjudendu a batteria à diversi putenziali (cuminciendu da -110 mV) è aumentendu a tensione in passi di 5 mV. A pruduzzione di AP hè stata testata applicendu una corrente depolarizante. Chjappate a cellula à -70 mV mentre applicate un impulsu di corrente depolarizante. Ajustate a dimensione di u passu di ogni unità di registrazione separatamente (da 10 à 60 pA). Calculate a frequenza massima di AP cuntendu manualmente i picchi d'impulsu chì causanu a frequenza AP più alta. A soglia di AP hè analizata utilizendu a seconda derivata di l'impulsu di depolarizazione chì prima attiva unu o più AP.
Cunfigurazione è analisi di u patch perforatu. Eseguite a registrazione di u patch perforatu utilizendu protokolli standard. Aduprate una pipetta senza ATP è GTP chì ùn cuntene micca i seguenti ingredienti: 128 mM gluconatu K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA è 2 mM MgCl2, è aghjustate à pH 7,2 (utilizendu KOH). ATP è GTP sò omessi da a suluzione intracellulare per impedisce a permeabilità incontrollata di a membrana cellulare. A pipetta di patch hè piena di una suluzione interna chì cuntene amfotericina (circa 200 à 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) per ottene una registrazione di patch perforata. L'amfotericina hè stata dissolta in dimetilsulfossido (cuncentrazione finale: 0,1 à 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). A cuncentrazione di DMSO aduprata ùn hà avutu alcun effettu significativu nantu à i neuroni studiati. Durante u prucessu di punzonatura, a resistenza di u canale (Ra) hè stata monitorata continuamente, è l'esperimentu hè statu iniziatu dopu chì l'amplitude di Ra è AP si sò stabilizate (20-40 minuti). L'attività spontanea hè misurata in una pinza di tensione è/o corrente per 2 à 5 minuti. L'analisi di i dati hè stata realizata cù Igor Pro (versione 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versione 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) è GraphPad Prism (versione 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA (Stati Uniti). Per identificà i PA spontanei, hè utilizatu u plug-in NeuroMatic v3.0c di IgorPro. Identificate automaticamente i PA utilizendu una data soglia, chì hè aghjustata individualmente per ogni record. Utilizendu l'intervallu di piccu, determinate a frequenza di piccu cù a frequenza di piccu massima istantanea è a frequenza media di piccu.
Isolamentu di PN. Adattendu si à u protocolu publicatu prima, i PN sò stati purificati da u cervellettu di u topu in un stadiu specificatu (58). In breve, u cervellettu hè statu dissezionatu è trituratu in un mezu di dissociazione ghiacciatu [senza HBSS Ca2+ è Mg2+, supplementatu cù 20 mM di glucosiu, penicillina (50 U/ml) è streptomicina (0,05 mg/ml)], è dopu digeritu u mezu in papaina [HBSS, supplementatu cù 1-cisteina·HCl (1 mg/ml), papaina (16 U/ml) è desossiribonucleasi I (DNasi I; 0,1 mg/ml)]. Trattatu per 30 minuti à 30°C. Prima lavate i tessuti in u mediu HBSS chì cuntene mucus d'ovu (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) è DNasi (0,1 mg/ml) à temperatura ambiente per impedisce a digestione enzimatica, è dopu in u mediu HBSS chì cuntene 20 mM di glucosiu. Macinate delicatamente in HBSS, penicillina (50 U/ml), streptomicina (0,05 mg/ml) è DNasi (0,1 mg/ml) per liberà e singole cellule. A sospensione cellulare risultante hè stata filtrata attraversu un colino cellulare di 70 μm, poi e cellule sò state pellettate per centrifugazione (1110 rpm, 5 minuti, 4°C) è risospese in u mediu di cernita [HBSS, supplementatu cù 20 mM di glucosiu, 20% di sieru fetale bovinu), penicillina (50 U/ml) è streptomicina (0,05 mg/ml)]; valutate a viabilità cellulare cù ioduro di propidiu è aghjustate a densità cellulare da 1×10⁶ à 2×10⁶ cellule/ml. Prima di a citometria di flussu, a sospensione hè stata filtrata attraversu un colatore cellulare di 50 μm.
Citometru di flussu. A classificazione cellulare hè stata effettuata à 4°C cù a macchina FACSAria III (BD Biosciences) è u software FACSDiva (BD Biosciences, versione 8.0.1). A sospensione cellulare hè stata classificata cù una bocca di 100 μm sottu una pressione di 20 psi à una velocità di ~2800 eventi/sec. Siccomu i criteri tradiziunali di gating (dimensione di a cellula, discriminazione bimodale è caratteristiche di scattering) ùn ponu micca assicurà l'isolamentu currettu di PN da altri tipi di cellule, a strategia di gating hè stabilita in basa à a paragone diretta di l'intensità YFP è di l'autofluorescenza in i topi mitoYFP+ ​​​​è i topi di cuntrollu mitoYFP −. YFP hè eccitatu irradiendu u campione cù una linea laser di 488 nm, è u signale hè rilevatu cù un filtru passa-banda di 530/30 nm. In i topi mitoYFP+ ​​​​, a forza relativa di u genu reporter Rosa26-mitoYFP hè ancu aduprata per distingue i frammenti di u corpu neuronale è di l'assoni. 7-AAD hè eccitatu cù un laser giallu di 561 nm è rilevatu cù un filtru passa-banda di 675/20 nm per escludere e cellule morte. Per separà l'astrociti à u listessu tempu, a sospensione cellulare hè stata culurata cù ACSA-2-APC, dopu u campione hè statu irradiatu cù una linea laser di 640 nm, è un filtru passa-banda di 660/20 nm hè statu utilizatu per rilevà u signale.
E cellule raccolte sò state pellettate per centrifugazione (1110 rpm, 5 minuti, 4°C) è cunservate à -80°C finu à l'usu. I topi Mfn2cKO è i so cuccioli sò classificati u listessu ghjornu per minimizà a variabilità procedurale. A presentazione è l'analisi di i dati FACS sò state realizate cù u software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Cum'è mintuvatu sopra (59), a PCR in tempu reale hè aduprata per isolà u DNA da i neuroni urdinati per a successiva quantificazione di u mtDNA. A linearità è a sensibilità di soglia sò state inizialmente testate eseguendu qPCR nantu à diversi numeri di cellule. In breve, raccoglie 300 PN in un buffer di lisi custituitu da 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 è proteinasi K (200 ng/ml) è incuba à 55°C per 120 minuti. E cellule sò state ulteriormente incubate à 95°C per 10 minuti per assicurà l'inattivazione cumpleta di a proteinasi K. Usendu una sonda TaqMan (Thermo Fisher) specifica per mt-Nd1, u mtDNA hè statu misuratu per PCR semiquantitativa in u sistema 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, numeru di catalogu Mm04225274_s1), geni mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numeru di catalogu AIVI3E8) è 18S (Thermo Fisher Scientific, numeru di catalogu Hs99999901_s1).
Preparazione di u campione di proteoma. Riscaldendu a suluzione à 95°C per 10 minuti è sonicendu, in u buffer di lisi [6 M cloruru di guanidina, 10 mM cloridrato di tris(2-carboxietil)fosfina, 10 mM cloroacetamide è 100 mM pellet di neuroni congelati di tris-Lise in HCl]. Nantu à Bioruptor (Diagenode) per 10 minuti (30 secondi di impulsu / 30 secondi di pausa). U campione hè statu diluitu 1:10 in 20 mM di tris-HCl (pH 8.0), mischiatu cù 300 ng di tripsina oru (Promega), è incubatu tutta a notte à 37°C per ottene una digestione cumpleta. U secondu ghjornu, u campione hè statu centrifugatu à 20.000 g per 20 minuti. U surnatante hè statu diluitu cù 0,1% d'acidu formicu, è a suluzione hè stata dissalata cù StageTips fatti in casa. U campione hè statu seccu in un strumentu SpeedVac (concentratore Eppendorf plus 5305) à 45°C, è dopu u peptide hè statu suspesu in 0,1% d'acidu formicu. Tutti i campioni sò stati preparati simultaneamente da a stessa persona. Per analizà i campioni d'astrociti, 4 μg di peptidi dissalati sò stati marcati cù un tag di massa tandem (TMT10plex, numeru di catalogu 90110, Thermo Fisher Scientific) cù un rapportu peptide/reagente TMT di 1:20. Per a marcatura TMT, 0,8 mg di reagente TMT sò stati risospesi in 70 μl di ACN anidru, è u peptide seccu hè statu ricostituitu in 9 μl di 0,1 M TEAB (bicarbonatu di trietilammoniu), à quale sò stati aghjunti 7 μl di reagente TMT in ACN. A cuncentrazione era di 43,75%. Dopu à 60 minuti d'incubazione, a reazione hè stata spenta cù 2 μl di 5% d'idrossilammina. I peptidi marcati sò stati raccolti, secchi, risospesi in 200 μl di acidu formicu (FA) à 0,1%, divisi in dui, è dopu dissalati aduprendu StageTips fatti in casa. Aduprendu un cromatografu liquidu à prestazioni ultra elevate UltiMate 3000 (cromatografu liquidu à prestazioni ultra elevate UltiMate 3000), una di e duie metà hè stata frazziunata nantu à una colonna cromatografica Acquity di 1 mm x 150 mm piena di particelle C18 da 130 Å1,7 μm (Waters, numeru di catalogu SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separate i peptidi à una velocità di flussu di 30 μl/min, separate da buffer B da 1% à 50% per 85 minuti cù un gradiente graduale di 96 minuti, da buffer B da 50% à 95% per 3 minuti, dopu 8 minuti per buffer B à 95%. U buffer A hè 5% ACN è 10 mM bicarbonatu d'ammoniu (ABC), è u buffer B hè 80% ACN è 10 mM ABC. Raccoglie e frazioni ogni 3 minuti è cumminalle in dui gruppi (1 + 17, 2 + 18, ecc.) è asciugale in una centrifuga à vuoto.
Analisi LC-MS/MS. Per a spettrometria di massa, i peptidi (numeru r119.aq) sò stati separati nantu à una colonna analitica PicoFrit di 25 cm è 75 μm di diametru internu (nova lente obiettiva, numeru di parte PF7508250) equipaggiata cù un mediu ReproSil-Pur 120 C18-AQ di 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), Aduprate EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Germania). A colonna hè stata mantenuta à 50 °C. I buffer A è B sò 0,1% d'acidu formicu in acqua è 0,1% d'acidu formicu in 80% d'ACN, rispettivamente. I peptidi sò stati separati da u buffer B da 6% à 31% per 65 minuti è da u buffer B da 31% à 50% per 5 minuti cù un gradiente di 200 nl/min. I peptidi eluiti sò stati analizati nantu à un spettrometru di massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). A misurazione m/z di u precursore di peptidi hè realizata cù una risoluzione di 120 000 in l'intervallu da 350 à 1500 m/z. Utilizendu un'energia di collisione nurmalizzata di u 27%, u precursore u più forte cù un statu di carica da 2 à 6 hè sceltu per a scissione di a dissociazione di a trappola C à alta energia (HCD). U tempu di ciclu hè impostu à 1 s. U valore m/z di u frammentu di peptide hè statu misuratu in a trappola di ioni utilizendu u più chjucu bersagliu AGC di 5 × 104 è u tempu massimu di iniezione di 86 ms. Dopu a frammentazione, u precursore hè statu piazzatu nantu à a lista di esclusione dinamica per 45 s. I peptidi marcati cù TMT sò stati separati nantu à una colonna Acclaim PepMap di 50 cm è 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numeru di catalogu 164942), è i spettri di migrazione sò stati analizati nantu à un spettrometru di massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) equipatu cù apparecchiature FAIMS (ioni di forma d'onda asimmetrica à campu altu) (Thermo Fisher Scientific) chì funziona à duie tensioni di compensazione di -50 è -70 V. MS3 sceltu in basa à u precursore di sincronizazione hè utilizatu per a misurazione di u signale ionicu di u rapportu TMT. A separazione di i peptidi hè stata effettuata nantu à EASY-nLC 1200, utilizendu una eluzione di gradiente lineare di 90%, cù una cuncentrazione di buffer da 6% à 31%; u buffer A era 0,1% FA, è u buffer B era 0,1% FA è 80% ACN. A colonna analitica hè operata à 50 °C. Aduprate FreeStyle (versione 1.6, Thermo Fisher Scientific) per dividisce u schedariu originale secondu a tensione di compensazione FAIMS.
Identificazione è quantificazione di e proteine. Utilizendu u mutore di ricerca integratu Andromeda, i dati originali sò stati analizati utilizendu MaxQuant versione 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). In più di e sequenze di ricombinasi Cre è YFP ottenute da Aequorea victoria, i spettri di frammenti di peptidi sò stati cercati per a sequenza canonica è a sequenza di isoforme di u proteoma di riferimentu di u topu (ID Proteoma UP000000589, scaricatu da UniProt in maghju 2017). L'ossidazione di a metionina è l'acetilazione N-terminale di e proteine ​​sò state impostate cum'è mudificazioni variabili; a metilazione di a carbamoile di a cisteina hè stata impostata cum'è mudificazioni fisse. I parametri di digestione sò impostati à "specificità" è "tripsina/P". U numeru minimu di peptidi è peptidi rasoiu utilizati per l'identificazione di e proteine ​​hè 1; u numeru minimu di peptidi unichi hè 0. In e cundizioni di currispundenza di a mappa di i peptidi, a tarifa d'identificazione di e proteine ​​era 0,01. L'opzione "Secondu Peptide" hè abilitata. Aduprate l'opzione "currispundenza trà e corse" per trasferisce l'identificazioni riesciute trà diversi fugliali originali. Aduprate u rapportu minimu LFQ 1 per a quantificazione senza etichetta (LFQ) (60). L'intensità LFQ hè filtrata per almenu dui valori validi in almenu un gruppu di genotipi à ogni puntu di tempu, è hè extrapolata da una distribuzione nurmale cù una larghezza di 0,0,3 è spustassi in ghjò 1,8. Aduprate a piattaforma informatica Perseus (https://maxquant.net/perseus/) è R (https://r-project.org/) per analizà i risultati LFQ. Un test t moderatu à duie vie da u pacchettu software limma hè statu utilizatu per l'analisi di l'espressione differenziale (61). L'analisi esplorativa di i dati hè realizata utilizendu ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally è pheatmap. I dati proteomichi basati nantu à TMT sò stati analizati utilizendu MaxQuant versione 1.6.10.43. Ricerca di dati proteomichi grezzi da a basa di dati di proteomica umana di UniProt, chì hè stata telecaricata in settembre 2018. L'analisi include u fattore di currezzione di a purità isotopica furnitu da u fabricatore. Aduprate limma in R per l'analisi di l'espressione differenziale. I dati uriginali, i risultati di a ricerca in a basa di dati, è u flussu di travagliu è i risultati di l'analisi di i dati sò tutti almacenati in l'alleanza ProteomeXchange attraversu u repositoriu di partenarii PRIDE cù l'identificatore di u set di dati PXD019690.
L'annottazioni funziunali arricchiscenu l'analisi. U strumentu Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) hè statu utilizatu per determinà a ricchezza di i termini d'annottazioni funziunali di u set di dati à 8 settimane (Figura 1). In breve, a lista quantitativa di proteine ​​ottenuta da l'analisi di dati LC-MS/MS (spettrometria di massa tandem) hè aduprata cù i seguenti criteri di filtru: Mus musculus hè sceltu cum'è spezia è sfondate, è a categuria mostra chì u valore P aghjustatu da Benjamini per un arricchimentu 0,05 o inferiore hè cunsideratu significativu. Per questu graficu, sò mostrate e prime cinque categurie in eccessu in ogni cluster basate nantu à u valore P aghjustatu. Usendu test t multipli, aduprendu u prugramma di boost lineare à duie tappe di Benjamini, Krieger è Yekutieli (Q = 5%), l'analisi di l'espressione di e proteine ​​in u corsu di u tempu hè realizata nantu à i candidati impurtanti identificati in ogni categuria, è ogni riga hè analizata separatamente. Ùn ci hè bisognu di aduttà una SD consistente.
Per paragunà i risultati di stu studiu cù e basi di dati publicate è generà un diagramma di Venn in a Figura 1, avemu cumminatu a lista quantitativa di proteine ​​cù l'annotazioni MitoCarta 2.0 (24). Aduprate u strumentu in linea Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) per generà u diagramma.
Per infurmazioni dettagliate nantu à e procedure statistiche aduprate per l'analisi proteomica, vi pregu di cunsultà a sezzione currispundente di Materiali è Metodi. Per tutti l'altri esperimenti, l'infurmazioni dettagliate ponu esse truvate in a legenda currispundente. Salvu indicazione contraria, tutti i dati sò espressi cum'è media ± SEM, è tutte l'analisi statistiche sò state realizate cù u software GraphPad Prism 8.1.2.
Per materiali supplementari per questu articulu, per piacè vede http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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By E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomica di i neuroni disfunzionali hà rivelatu chì i prugrammi metabolichi sò attivati ​​per cuntrastà a neurodegenerazione.
By E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analisi proteomica di i neuroni disfunzionali hà rivelatu chì i prugrammi metabolichi sò attivati ​​per cuntrastà a neurodegenerazione.
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