Presente†Indirizzu attuale: OX11 0DE, Regnu Unitu, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Regnu Unitu, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
U cumplessu 1 di raccolta di luce di u centru di reazione (RC-LH1) hè u cumpunente fotosinteticu principale di i batteri fototrofichi viola. Avemu introduttu duie strutture di crio-microscopia elettronica di u cumplessu RC-LH1 di Rhodopseudomonas palustris. A struttura di risoluzione 2,65 Å di u cumplessu RC-LH114-W hè custituita da 14 circuiti di subunità LH1 chì circundanu RC, chì hè interrotta da a proteina W, mentre chì u cumplessu senza proteina-W hè cumpletamente cumpostu da RC circundatu da RC. Circuitu LH1 chjusu di 16 subunità. U paragone di queste strutture furnisce insights nantu à a dinamica di u chinone in u cumplessu RC-LH1, cumpresi cambiamenti cunfurmazionali prima indeterminati quandu si lega u chinone à u situ RC QB, è ancu a situazione di i siti di legame ausiliari di u chinone, chì aiutanu à passà li à RC. A struttura unica di a proteina W impedisce a chjusura di u circuitu LH1, creendu cusì un canale per accelerà u scambiu chinone/chinolone.
L'energia furnita da a fotosintesi pò sustene guasi tutta a vita nantu à a terra, è hà un grande putenziale per a biotecnologia solare. Mentre prumove a fotosintesi glubale, i batteri fototrofi viola mostranu ancu diversi modi energetichi è capacità metaboliche. Puderanu evità a fotosintesi è cresce cum'è batteri eterotrofi in u bughju, ponu fissà l'azotu è u diossidu di carbonu, pruduce idrogenu è degradà i cumposti aromatichi (1-3). Per furnisce energia per questi prucessi, a luce deve esse cunvertita rapidamente è efficacemente in energia chimica. Stu prucessu principia quandu u cumplessu di l'antenna chì intrappula a luce assorbe a luce è trasferisce l'energia intrappulata à u centru di reazione (RC), cuminciendu cusì a separazione di carica (4-7). L'unità basica di a fotosintesi in i batteri fototrofi viola hè cumposta da RC di tipu 2, circundata da u cumplessu di raccolta di luce 1 (LH1), chì forma u cumplessu principale RC-LH1. LH1 hè furmatu da una schiera di eterodimeri αβ curvi, ognunu di i quali lega duie molecule di clorofilla batterica (BChl) a è unu o dui carotenoidi (8-12). L'antenna LH1 a più simplice hè custituita da 16 o 17 eterodimeri αβ chì circundanu RC (9-13) in un ciclu chjusu, ma in altri cumplessu core, i peptidi transmembrana interrompenu a continuità di l'LH1 circundante, prumove cusì a diffusione di chinolo/chinone trà RC è u cumplessu di citocromo bc1 (11, 13-15). A pianta fototrofa viola Rhodopseudomonas (Rps.) hè un urganisimu mudellu chì pò capisce u trasferimentu di energia è elettroni chì sustene a fotosintesi. A prima struttura cristallina di Rps. U mudellu di u cumplessu RC-LH1 palustris hè RC, circundatu da 15 cicli LH1 eterodimerichi, chì sò interrotti da una proteina scunnisciuta chjamata "Protein W" (14). A Protein-W hè stata successivamente identificata cum'è RPA4402, chì hè una proteina di 10,5 kDa micca caratterizata cù trè eliche transmembrana (TMH) previste (16). Pruponemu di rinominà u genu rpa4402 chì codifica a proteina W in pufW per esse coerente cù a nomenclatura aduprata per i geni chì codificanu e subunità RC-L, M (pufL, pufM) è LH1α, β (pufA, pufB). Hè interessante nutà chì a proteina-W hè presente solu in circa u 10% di RC-LH1, rivelendu chì Rps. palustris produce dui cumplessu RC-LH1 diversi. Quì, riportemu e strutture cryo-EM (cryo-EM) à alta risoluzione di dui cumplessu principali, unu cù a proteina W è 14 eterodimeri αβ, l'altru senza proteina W è un ciclu LH1 chjusu di 16 eterodimeri. A nostra struttura rapprisenta un cambiamentu radicale in a comprensione di u cumplessu RC-LH1 di Rps. palustris, perchè avemu analizatu a pupulazione omogenea di ogni variante è avemu una risoluzione sufficiente per assignà chjaramente ogni peptide è i pigmenti ligati è i lipidi è i chinoni correlati. A paragunazione di ste strutture mostra chì e trè proteine ​​TMH-W chì ùn sò state truvate finu à avà in nisun altru cumplessu RC-LH1 generanu un canale chinonicu per accelerà u scambiu chinonicu/chinolone. Un certu numeru di siti di legame lipidicu è chinonicu cunservati sò stati identificati, è avemu rivelatu un novu cambiamentu cunfurmazionale dopu a cumbinazione di chinonicu è RC, chì pò esse adattatu per u fotosistema II (PSII) RC di l'organismi fototrofi ossigenati. I nostri risultati furniscenu novi insights nantu à a cinetica di u legame è di u scambiu chinonicu/chinolone in u cumplessu centrale RC-LH1 di i batteri fototrofi viola.
Per facilità un studiu dettagliatu di i dui cumplessi truvati in Rps. palustris, isolemu ogni RC-LH1 per metudi biochimichi. U cumplessu deficiente di proteina W (in seguitu chjamatu ΔpufW) hè statu purificatu da a ceppa chì manca u genu pufW (16), è solu un cumplessu RC-LH1 pò esse pruduttu. U cumplessu chì cuntene a proteina W hè pruduttu da una ceppa. A proteina W di sta ceppa hè mudificata cù un tag His 10x à u so C-terminale, in modu chì u cumplessu chì cuntene a proteina W pò esse efficacemente cumminatu cù a maiò parte di a proteina W mancante immobilizendu u metallu. U cumplessu hè efficacemente separatu (16) Cromatografia d'Affinità (IMAC).
Cum'è mostratu in a Figura 1, i dui cumplessi cuntenenu un RC di trè sottuunità (RC-L, RC-M è RC-H) circundatu da un'antenna LH1. A struttura 2.80-A di u cumplessu senza proteina-W mostra 16 eterodimeri αβ, chì formanu un ciclu LH1 chjusu chì circunda cumpletamente RC, chjamatu in seguitu cumplessu RC-LH116. A struttura 2.65Å di u cumplessu chì cuntene a proteina-W hà un LH1 di 14 eterodimeri interrotti da a proteina-W, chjamatu in seguitu RC-LH114-W.
(A è B) Rappresentazione superficiale di u compostu. (C è D) Pigmenti ligati espressi in bastoncini. (E è F) I complessi osservati da a superficia citoplasmatica anu i peptidi è e subunità LH1 rapprisentati in cartoni animati, è sò numerati in sensu orariu da u gap proteina-W [coerente cù a numerazione Rba. Cumplessu sphaeroides (13)]. Per LH1-α, u culore di a subunità proteica hè giallu; per LH1-β, u culore di a subunità proteica hè turchinu; per a proteina-W, a proteina hè rossa; per RC-H, hè cianu; per RC-L, hè aranciu; per RC-M, magenta. I cofattori sò rapprisentati da bastoncini, u verde rapprisenta e molecule BChl è BPh a, u viulettu rapprisenta i carotenoidi, è u giallu rapprisenta e molecule UQ10. (G è H) Vista ingrandita di u gap proteina-W in a regione equivalente di u cumplessu RC-LH114-W (G) è di u cumplessu RC-LH116 (H). I cofattori sò mustrati in forma di riempimentu di spaziu, a chinona chelata hè mustrata in blu. U spaziu trà a proteina W hè evidenziatu da una linea tratteggiata blu in (G), è i picculi fori induve a chinona/chinololu si diffonde nantu à l'anellu LH116 sò evidenziati da una linea tratteggiata nera in (H).
A Figura 1 (A è B) mostra l'RC circundatu da schiere aperte o chjuse di eterodimeri LH1αβ, ognunu di i quali lega dui BChl è un carotenoide (Figura 1, C è D). Studi precedenti anu dimustratu chì Rps hè u cumplessu LH1. In a via biosintetica di a spirulina xantina, queste spezie cuntenenu pupulazioni miste di carotenoidi (17). Tuttavia, a spiropiroxantina hè u carotenoide dominante è a so densità hè soddisfacente. Dunque, avemu sceltu di mudellà a spiroxantina in tutti i siti di legame LH1. I polipeptidi alfa è beta sò TMH singuli cù regioni esterne di membrana corte (Figura 1, A, B, E è F). Ancu s'è a densità di 17 residui à u C-terminale ùn hè stata osservata, u polipeptide alfa hè statu scissu da Met1 à Ala46 in entrambi i complessi. U polipeptide β hè statu riduttu da Gly4 à Tyr52 in RC-LH116, è da Ser5 à Tyr52 in RC-LH114-W. Nisuna densità di 3 o 4 residui N-terminali o 13 C-terminali hè stata osservata (Figura S1). L'analisi di spettrometria di massa di u cumplessu RC-LH1 mistu preparatu da a ceppa di tipu salvaticu hà dimustratu chì a regione mancante era u risultatu di a scissione eterologa di sti peptidi (Figura S1 è S2). A furmilazione N-terminale di α-Met1 hè stata ancu osservata (f). L'analisi hà dimustratu chì l'α-peptide hè custituitu da residui fMet1 à Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, è u β-peptide hè custituitu da residui Ser2 à Ala53, chì hè in bon accordu cù a mappa di densità EM à bassa temperatura.
A coordinazione di α-His29 è β-His36 face chì i BChls sianu faccia à faccia; ogni eterodimeru αβ s'assembla cù i so vicini per furmà un ciclu apertu (RC-LH114-W) o un ciclu chjusu (RC-LH116) intornu à a matrice di pigmenti accoppiati à eccitoni RC (Figura 1, C è D). In paragone cù a banda di 877 nm di RC-LH114-W, u redshift di assorbimentu di 880 nm di RC-LH116 hè di 3 nm (Figura 2A). Tuttavia, u spettru di dicroismu circulare hè guasi u listessu (Figura 2B), chì indica chì, ancu s'ellu ci hè una chiara differenza trà i cicli aperti è chjusi, l'ambiente lucale di i BChls hè assai simile. U redshift di assorbimentu pò esse u risultatu di un muvimentu termicu riduttu è di una maggiore stabilità in u ciclu chjusu (18, 19), u cambiamentu in l'accoppiamentu di pigmenti causatu da u ciclu chjusu (20, 21), o una cumminazione di questi dui effetti (11).
(A) Spettru d'assorbimentu ultraviolettu/visibile/vicinu à l'infrarossu, i picchi di u quale sò marcati cù i so pigmenti currispondenti è nurmalizati à u piccu BPh à 775 nm. (B) Spettru di dicroismu circulare nurmalizatu à l'assorbanza BChl à 805 nm. (C è D) Spettri ΔA selezziunati da i spettri d'assorbimentu risolti in u tempu di u cumplessu RC-LH114-W (C) è di u cumplessu RC-LH116 (D). Per una megliu paragunabilità, tutti i spettri sò nurmalizati à ∆A di −A à 0,2 ps. (E) A velocità di l'ossidazione di u citocromu c2 dopu l'irradiazione in presenza di varie concentrazioni di UQ2 (vede a Figura S8 per i dati grezzi). (F) In cellule cultivate sottu luce di bassa, media o alta intensità (10, 30 o 300μMm-2 s-1, rispettivamente), e subunità di a proteina W è RC-L in u cumplessu purificatu è u rapportu di membrana separatu. Determinate u livellu di proteine ​​per elettroforesi in gel di SDS-poliacrilamide è immunodosaggio (vede a Figura S9 per i dati grezzi). Determinate u rapportu relativu à u cumplessu RC-LH114-W purificatu. U rapportu stechiometricu di RC-L à proteina-W di u cumplessu hè 1:1.
I BChls in pusizione 1 in u ciclu αβ14 deformatu di RC-LH114-W (Figura 1, A, C, è E) sò più vicini à u donatore primariu RC (P) di 6,8 Å chè i BChls equivalenti in RC-LH116 (Figura 1, B, D, è F, è Figura S3); tuttavia, a cinetica di assorbimentu transitoria di i dui complessi mostra chì per RC-LH114-W è RC-LH116, e custanti di tempu di trasferimentu di l'energia di eccitazione da LH1 à RC sò 40 ± 4 è 44 ± 3 ps (Figura 2). , C è D, Figura S4 è Tavula S2). Ùn ci hè ancu alcuna differenza significativa in u trasferimentu elettronicu in RC (Figura S5 è testu supplementariu cunnessu). Suspettemu chì a stretta currispundenza di u tempu di trasferimentu di l'energia trà LH1 è RC-P hè dovuta à a distanza, l'angulu è l'energia potenziale simili di a maiò parte di i BChl in i dui cicli LH1. Pare chì esplorà u mudellu energeticu LH1 per ghjunghje à a distanza minima ùn hè micca più veloce chè u trasferimentu direttu di energia da siti subottimali à RC. U ciclu LH1 à ciclu apertu in RC-LH114-W pò ancu subisce un muvimentu termicu insignificante in cundizioni di bassa temperatura per l'analisi strutturale, è ci hè una cunfurmazione di l'anellu αβ14 più longa à temperatura ambiente da a distanza di pigmentazione di βBChls in a pusizione di RC 1.
U cumplessu RC-LH116 cuntene 32 BChls è 16 carotenoidi, è a so dispusizione generale hè a listessa chè quella ottenuta da Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 ceppo (PDB ID 7C9R) (12) è alghe verdi (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Dopu l'allineamentu, sò state osservate solu piccule deviazioni in e pusizioni di l'eterodimeri αβ, in particulare 1-5, 15 è 16 (Figura S6). A presenza di a proteina-W hà un impattu significativu nantu à a struttura di LH1. I so trè TMH sò cunnessi da brevi circuiti, cù l'N-terminale nantu à u latu lume di u cumplessu è u C-terminale nantu à u latu citoplasmaticu (Figure 1A è 3, da A à D). A proteina-W hè largamente idrofobica (Figura 3B), è TMH2 è TMH3 interagiscenu cù LH1αβ-14 per furmà una superficia transmembrana (Figura 3, B è E à G). L'interfaccia hè cumposta principalmente da residui Phe, Leu è Val in a regione transmembrana. Quessi residui sò impilati cù aminoacidi idrofobici è pigmenti αβ-14. Certi residui polari cuntribuiscenu ancu à l'interazione, cumpresu u ligame à idrogenu trà W-Thr68 è β-Trp42 nantu à a superficia di a cavità cumplessa (Figura 3, F è G). Nantu à a superficia di u citoplasma, Gln34 hè adiacente à u gruppu cheto di i carotenoidi αβ-14. Inoltre, a molecula di n-dodecil β-d-maltoside (β-DDM) hè stata risolta, è a so coda idrofobica s'hè estesa à l'interfaccia trà a proteina-W è αβ-14, è a coda lipidica pò esse situata in u corpu. Avemu ancu nutatu chì e regioni di risoluzione C-terminali di a proteina W è RCH sò assai vicine, ma micca in u scopu di furmà interazioni specifiche (Figura 1, A è E). Tuttavia, ci ponu esse interazioni in l'aminoacidi C-terminali micca risolti di queste duie proteine, chì ponu furnisce un mecanismu per u recrutamentu di a proteina-W durante l'assemblea di u cumplessu RC-LH114-W.
(A) A Proteina-W, chì si trova di fronte à l'interfaccia cù LH1αβ14 in forma di cartone animatu, hà una catena laterale in forma di bastone (rossu), mustrata in una parte di u diagramma di putenziale elettrostaticu (superficie grisgia trasparente cù un livellu di contornu di 0,13). (B) A Proteina-W hè rapprisintata da una superficia culurata idrofobica. E zone polari è cariche sò mustrate in cianu, e zone idrofobiche sò mustrate in biancu, è e zone fortemente idrofobiche sò mustrate in aranciu. (C è D) A Proteina-W hè rapprisintata in cartone animatu, a so orientazione hè a listessa cum'è in (A) (C), è hè stata rotata di 180° (D). Sicondu a pusizione in a sequenza, i residui distinguibili aduttanu un schema di culori arcubalenu, induve l'N-terminale hè turchinu è u C-terminale hè rossu. (E) A Proteina-W hè vista cum'è in (A), è i residui à l'interfaccia di a proteina-W:LH1 sò rapprisintati da bastoni cù marchi attaccati. (F) A Proteina-W hè rotata di 90° in relazione à (E) è LH1αβ14 in a rapprisentazione di u cartone animatu, è in relazione à i residui di l'interfaccia in a rapprisentazione à barre. I residui sporgenti di u polipeptide beta sò etichettati. U cofattore hè mostratu cum'è una barra chì currisponde à u culore di a Figura 1, u β-DDM decompostu hè mostratu in grisgiu, è l'ossigenu hè mostratu in rossu. (G) A vista in (F) hè rotata di 180°, cù i residui prominenti di u polipeptide alfa marcatu.
A Proteina-W rimpiazza un eterodimeru αβ (u 15esimu in a Figura 1F), impedendu cusì a chjusura di u ciclu è inclinendu i primi trè eterodimeri αβ. Hè statu osservatu chì l'angulu d'inclinazione massima di u primu eterodimeru αβ-1 in relazione à a normale di u film era da 25° à 29° (Figura 1, A è E), chì hè statu furmatu da l'inclinazione da 2° à 8° di αβ-1 in RC Un forte cuntrastu-LH116 (Figura 1, B è F). U secondu è u terzu eterodimeru sò inclinati rispettivamente da 12° à 22° è da 5° à 10°. A causa di l'impedimentu stericu di RC, l'inclinazione di αβ-1 ùn include micca a seconda coppia di αβ (chì currisponde à u 16esimu αβ in a Figura 1F), furmendu cusì un spaziu chjaru in l'anellu LH1 (Figura 1, A è E). A causa di a mancanza di dui eterodimeri αβ, accumpagnata da a perdita di quattru BChl è dui carotenoidi, nisunu di i carotenoidi si lega à a subunità αβ-1 ritorta, risultendu in un anellu LH114-W chì cuntene 13 carotenoidi Vegetariani è 28 BChl. E stime di risoluzione lucale di i dui cumplessu in e regioni da αβ1 à 7 sò più basse di quelle di u restu di u ciclu LH1, ciò chì pò riflette a plasticità inerente di a subunità LH1 adiacente à u situ RC QB (Figura 4).
L'imagine di RC-LH114-W (A è B) è RC-LH116 (C è D) sò mostrate da a listessa vista superiore/laterale (A è B) (A è C) è a superficia di a cavità di a Fig. 1. (B è D). I tasti culurati sò mostrati à diritta.
L'unicu altru cumplessu core caratteristicu cù un rapportu stechiometricu di 1:14 hè u dimeru Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Tuttavia, a proteina W è PufX ùn anu micca una omologia evidente, è anu un impattu significativu nantu à e so rispettive strutture LH1. PufX hè un unicu TMH cù un duminiu citoplasmaticu N-terminale chì interagisce cù u latu citoplasmaticu di a subunità RC-H (13) in una pusizione currispondente à Rps. palustris LH116αβ-16. PufX crea un canale per u scambiu chinone/chinolone trà RC-LH1 è u cumplessu di citocromu bcl è hè presente in tutti i cumplessi core Rba. sphaeroides (13). Ancu s'è l'interfaccia monomeru-monomeru hè in Rba. U dimeru sphaeroides RC-LH1-PufX hè situatu à a pusizione di legame di a proteina W in RC-LH114-W, è u spaziu induttu da PufX è a proteina-W hè in una pusizione equivalente (Figura S7A). U spaziu in RC-LH114-W hè ancu allinatu cù l'ipoteticu canale chinone (8) di Pseudomonas rosea LH1, chì hè furmatu da peptidi micca ligati à a proteina W o PufX (Figura S7B). Inoltre, u canale chinone in Blc. U verde smeraldo LH1 furmatu escludendu una subunità γ (7) hè situatu in una pusizione simile (Figura S7C). Ancu s'ellu hè mediatu da diverse proteine, l'apparizione di sti canali chinone/chinololo in una pusizione cumuna in u cumplessu RC-LH1 pare esse un esempiu di evoluzione convergente, chì indica chì u spaziu creatu da a proteina W pò agisce cum'è un canale chinone.
U spaziu in u ciclu LH114-W permette a furmazione di una regione di membrana cuntinua trà u spaziu internu di u cumplessu RC-LH114-W è a membrana di massa (Figura 1G), invece di cunnette i dui duminii attraversu un poru proteicu cum'è in e proteine. U cumplessu RC-LH116 hè simile à un cumplessu chjusu in forma d'agulla Tch. (22) (Figura 1H). Siccomu a diffusione di chinone attraversu a membrana hè più rapida chè a diffusione attraversu u canale proteicu strettu, u ciclu LH114-W apertu pò permette un turnover RC più veloce chè u ciclu LH116 chjusu, è a diffusione di chinone in u RC pò esse più ristretta. Per verificà se a proteina W influenza a cunversione di chinoni attraversu RC, avemu realizatu un test di ossidazione di citocromu nantu à una certa concentrazione di ubiquinone 2 (UQ2) (un analogu di UQ10 naturale cù una coda di isoprene più corta) (Figura 2E). Ancu s'è a prisenza di chinone chelata impedisce a determinazione precisa di a custante apparente di Michaelis (RC-LH114-W è RC-LH116 sò adatti per 0,2 ± 0,1 μM è 0,5 ± 0,2 μM, rispettivamente), a velocità massima di RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) hè 28 ± 5% più grande di RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Inizialmente avemu stimatu chì a proteina-W hè presente in circa u 10% di u cumplessu core (16); quì, i tassi d'occupazione di e cellule di crescita in poca luce, media luce è alta luce sò rispettivamente 15 ± 0,6%, 11 ± 1% è 0,9 ± 0,5% (Figura 2F). U paragone quantitativu di a spettrometria di massa hà dimustratu chì l'aghjunta di u tag d'istidina ùn hà micca riduttu l'abbundanza relativa di proteina-W paragunata à i ceppi di tipu salvaticu (P = 0,59), dunque questi livelli ùn sò micca un artefattu di proteina-W mudificata (Figura S10). Tuttavia, sta bassa occupazione di proteina-W in u cumplessu RC-LH1 pò permette à alcune RC di flipà à un ritmu acceleratu, mitigendu cusì u scambiu più lentu di chinone / chinolone in u cumplessu RC-LH116. Avemu nutatu chì l'altu tassu d'occupazione di a luce hè incoerente cù i dati trascrittomici recenti, chì indicanu chì l'espressione di u genu pufW aumenta sottu à una luce forte (Figura S11) (23). A differenza trà a trascrizione di pufW è l'incorporazione di proteina-W in u cumplessu RC-LH1 hè cunfusa è pò riflette a regulazione cumplessa di a proteina.
In RC-LH114-W, 6 cardiolipine (CDL), 7 fosfatidilcoline (POPC), 1 fosfatidilglicerolu (POPG) è 29 molecule di β-DDM sò state attribuite è modellate in 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG è 12 βDDM. RC-LH116 (Figura 5, A è B). In queste duie strutture, CDL hè guasi situatu nantu à u latu citoplasmaticu di u cumplessu, mentre chì POPC, POPG è β-DDM sò principalmente situati nantu à u latu luminale. Dui molecule lipidiche è di detergente sò state isolate in a regione αβ-1 à αβ-6 di u cumplessu RC-LH114-W (Figura 5A), è cinque sò state isolate in a regione equivalente di RC-LH116 (Figura 5B). Più lipidi sò stati trovati da l'altra parte di u cumplessu, principalmente CDL, accumulati trà RC è αβ-7 à αβ-13 (Figura 5, A è B). Altri lipidi è detergenti strutturalmente risolti sò situati fora di l'anellu LH1, è e catene aciliche ben risolte si estendenu trà e subunità LH1, designate pruvisoriamente cum'è β-DDM in RC-LH114-W, è definite cum'è β-DDM in RC Una mistura di β-DDM è POPC-LH116. E pusizioni simili di lipidi è detergenti chelanti in a nostra struttura indicanu ch'elli sò siti di ligame fisiologicamente pertinenti (Figura S12A). E pusizioni di molecule equivalenti in Tch anu ancu una bona consistenza. Gentle è Trv. Strain 970 RC-LH1s (Figura S12, B à E) (9, 12) è i residui di ligame à l'idrogenu di u gruppu di testa lipidica anu mostratu una cunservazione abbastanza bona in l'allineamentu di sequenza (Figura S13), chì indica chì CDL cunservata chì si lega à RC (24), questi siti ponu esse cunservati in u cumplessu RC-LH1.
(A è B) I peptidi RC-LH114-W (A) è RC-LH116 (B) sò rapprisentati da cartoni animati, è i pigmenti sò rapprisentati da bastoncini, utilizendu u schema di culori in a Figura 1. I lipidi sò mostrati in rossu, è i detergenti sò mostrati in grisgiu. L'UQ ligata à i siti RC QA è QB hè gialla, mentre chì l'UQ isolata hè blu. (C è D) E stesse viste cum'è (A) è (B), cù i lipidi omessi. (Da E à G) Vista ingrandita di Q1(E), Q2(F) è Q3(G) da RC-LH116, cù catene laterali chì s'influenzanu reciprocamente. I ligami à l'idrogenu sò mostrati cum'è linee tratteggiate nere.
In RC-LH116, sia RC QA sia QB UQ, chì participanu à u trasferimentu di l'elettroni in u prucessu di separazione di carica, sò decomposti in i so siti di ligame. Tuttavia, in RC-LH114-W, a chinona QB ùn hè stata risolta è serà discussa in dettagliu quì sottu. In più di i chinoni QA è QB, duie molecule UQ chelate (situate trà l'anelli RC è LH1) sò attribuite in a struttura RC-LH114-W secondu i so gruppi di testa ben risolti (situati in Q1 è Q2, rispettivamente). spaziu). Figura 5C). Dui unità di isoprene sò attribuite à Q1, è a mappa di densità risolve e 10 code di isoprene cumplete di Q2. In a struttura di RC-LH116, trè molecule UQ10 chelate (Q1 à Q3, Figura 5D) sò state risolte, è tutte e molecule anu una densità chjara in tutta a coda (Figura 5, D à G). In e duie strutture, e pusizioni di i gruppi di testa di chinone di Q1 è Q2 anu una cunsistenza eccellente (Figura S12F), è interagiscenu solu cù RC. Q1 si trova à l'entrata di u spaziu W di RC-LH114-W (Figura 1G è 5, C, D è E), è Q2 si trova vicinu à u situ di ligame QB (Figura 5, C, D) è F). I residui cunservati L-Trp143 è L-Trp269 sò assai vicini à Q1 è Q2 è furniscenu potenziali interazzione di π-stacking (Figura 5, E è F, è Figura S12). L-Gln88, à 3,0 Å da l'ossigenu distale di Q1, furnisce un forte ligame à l'idrogenu (Figura 5E); questu residuu hè cunservatu in tutti i RC eccettu a relazione più distante (Figura S13). L-Ser91 hè sustituitu cunservativamente per Thr in a maiò parte di l'altri RC (Figura S13), hè à 3,8 Angstrom da l'ossigenu metilicu di Q1, è pò furnisce ligami d'idrogenu debuli (Figura 5E). Q3 ùn pare micca avè una interazione specifica, ma si trova in a regione idrofobica trà a subunità RC-M è a subunità LH1-α 5 à 6 (Figura 5, D è G). Q1, Q2 è Q3 o chinoni chelati vicini sò stati ancu risolti in Tch. Gentle, Trv. Strain 970 è Blc. A struttura di l'iride (9, 10, 12) indica un situ di ligame di chinone ausiliariu cunservatu in u cumplessu RC-LH1 (Figura S12G). I cinque UQ decomposti in RC-LH116 sò in bon accordu cù u 5,8 ± 0,7 di ogni cumplessu determinatu da a cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), mentre chì i trè UQ decomposti in RC-LH114-W sò inferiori à. U valore misuratu di 6,2 ± 0,3 (Fig. S14) indica chì ci sò molecule UQ micca risolte in a struttura.
I polipeptidi L è M pseudo-simmetrici cuntenenu ognunu cinque TMH è formanu un eterodimeru chì combina un dimeru BChl, dui monomeri BChl, dui monomeri batteriofagi (BPh), è un ferru non eme è una o duie molecule UQ10. Per via di a presenza di ligami d'idrogenu nantu à u gruppu chetone terminale è a so accumulazione cunnisciuta in Rps, i carotenoidi sò incorporati in a subunità M, chì hè chjamata cis-3,4-deidroorodopina. Specie (25). U duminiu di a membrana esterna di RC-H hè ancoratu à a membrana da un unicu TMH. A struttura generale RC hè simile à e trè subunità RC di spezie correlate (cum'è Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). I macrocicli di BChl è BPh, a spina dorsale carotenoide è u ferru non eme si sovrappongono in a gamma di risoluzione di queste strutture, cum'è u gruppu di testa UQ10 in u situ QA è u chinone QB in RC-LH116 (Figura S15).
A dispunibilità di duie strutture RC cù diversi tassi d'occupazione di u situ QB offre una nova opportunità per esaminà i cambiamenti cunfurmazionali consistenti chì accumpagnanu u ligame di a chinona QB. In u cumplessu RC-LH116, a chinona QB si trova in a pusizione "prossimale" cumpletamente ligata (26), ma a separazione di RC-LH114-W ùn hà micca chinona QB. Ùn ci hè micca chinona QB in RC-LH114-W, ciò chì hè surprenante perchè u cumplessu hè attivu, più chè u cumplessu RC-LH116 cù chinona QB strutturalmente risolta. Ancu s'è i dui anelli LH1 chelanu circa sei chinoni, cinque sò strutturalmente risolti in l'anellu RC-LH116 chjusu, mentre chì solu trè sò strutturalmente limitati in l'anellu RC-LH114-W apertu. Questu aumentu di u disordine strutturale pò riflette a sustituzione più rapida di i siti QB RC-LH114-W, una cinetica di chinona più rapida in u cumplessu è una maggiore probabilità di attraversà u ciclu LH1. Suggeremu chì a mancanza di UQ in u situ RC QB di RC-LH114-W puderia esse u risultatu di un cumplessu più cumplessu è più attivu, è u situ QB di RC-LH114-W hè statu subitu congelatu in u turnover di UQ. A fase specifica (l'entrata à u situ QB hè stata chjusa) riflette a cunfurmazione di sta attività.
Senza QB, a rotazione accumpagnatrice di L-Phe217 versu una pusizione incompatibile cù u ligame UQ10, perchè pruvucarà una collisione spaziale cù a prima unità d'isoprene di a coda (Figura 6A). Inoltre, i principali cambiamenti cunfurmazionali evidenti sò evidenti, in particulare l'elica de (elica corta in u cicculu trà TMH D è E) induve L-Phe217 hè spustatu versu a sacchetta di ligame QB è a rotazione di L-Tyr223 (Figura 6A) per rompe u ligame à l'idrogenu cù u quadru M-Asp45 è chjude l'entrata di u situ di ligame QB (Figura 6B). L'elica de pivota à a so basa, u Cα di L-Ser209 hè spustatu di 0,33 Å, mentre chì L-Val221Cα hè spustatu di 3,52 Å. Ùn ci sò cambiamenti osservabili in TMH D è E, chì sò sovrapponibili in entrambe e strutture (Figura 6A). À a nostra cunniscenza, sta hè a prima struttura in u RC naturale chì chjude u situ QB. Una paragone cù a struttura cumpleta (ligata à QB) mostra chì prima chì a quinone sia ridutta, hè necessariu un cambiamentu cunfurmazionale per fà la entre in a quinone. L-Phe217 gira per furmà una interazione π-stacking cù u gruppu di testa di a quinone, è l'elica si sposta versu l'esternu, permettendu à u scheletru di L-Gly222 è à a catena laterale di L-Tyr223 di furmà una rete di legami à idrogenu cù una struttura di legami à idrogenu stabile (Figura 6, A è C).
(A) Cartone animatu sovrappostu di l'ologramma (catena L, catena aranciu/M, magenta) è di a struttura apo (grigia), in a quale i residui chjave sò visualizati in forma di una rapprisentazione à forma di bastone. UQ10 hè rapprisentatu da una barra gialla. A linea punteggiata indica i ligami à l'idrogenu furmati in tutta a struttura. (B è C) A rapprisentazione superficiale di l'apolipoproteina è di tutta a struttura à l'anellu, mettendu in risaltu l'ossigenu di a catena laterale di L-Phe217 in blu è L-Tyr223 in rossu, rispettivamente. A subunità L hè aranciu; e subunità M è H ùn sò micca culurite. (D è E) Apolipoproteina (D) è siti RC QB interi (E) [culurati da (A) rispettivamente] è PSII di Thermophilus thermophilus (verde, blu cù chinone plasticu; ID PDB: 3WU2) Allineate (58).
Inaspettatamente, ancu s'è parechje strutture di RC deficienti di QB senza LH1 sò dispunibili, i cambiamenti cunfurmazionali osservati in questu studiu ùn sò stati signalati prima. Quessi includenu a struttura di deplezione di QB da Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) è Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), chì sò tutti guasi listessi à a so struttura QB generale. Un'ispezione attenta di 3PRC hà rivelatu chì e molecule di detergente LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) si leganu à l'entrata di a pusizione QB, ciò chì pò impedisce u riarrangiamentu in una cunfurmazione chjusa. Ancu s'è LDAO ùn si decompone micca à a listessa pusizione in 1EYS o 1OGV, questi RC sò preparati cù u listessu detergente è dunque ponu pruduce u listessu effettu. A struttura cristallina di Rba. Sphaeroides RC co-cristallizatu cù u citocromu c2 (PDB ID: 1L9B) pare ancu avè un situ QB chjusu. Tuttavia, in questu casu, a regione N-terminale di u polipeptide RC-M (interagendu cù u situ di legame QB attraversu u ligame H di u residu Tyr nantu à l'elica Q) adotta una cunfurmazione innaturale, è u cambiamentu cunfurmazionale QB ùn hè micca esploratu più in dettagliu (30). Ciò chì hè rassicurante hè chì ùn avemu micca vistu stu tipu di deformazione di u polipeptide M in a struttura RC-LH114-W, chì hè guasi a stessa chè a regione N-terminale di RC-LH116 RC. Ci vole ancu à nutà chì dopu l'eradicazione di l'antenna LH1 basata nantu à u detergente, l'apolipoproteine ​​RC in u PDB sò state risolte, ciò chì hà eliminatu i pools interni di chinone è i lipidi in u spaziu trà l'RC è a superficia interna di l'anellu LH1 circundante (31, 32). RC ferma funziunale perchè conserva tutti i cofattori, eccettu per a chinona QB decomposabile, chì hè menu stabile è hè spessu persa durante u prucessu di preparazione (33). Inoltre, hè cunnisciutu chì a rimuzione di LH1 è di lipidi ciclici naturali da RC pò avè un impattu nantu à e funzioni, cum'è a durata di vita più corta di u statu P+QB separatu da carica (31, 34, 35). Dunque, ipotemu chì l'esistenza di l'anellu LH1 lucale chì circonda RC pò mantene u situ QB "chjusu", priservendu cusì l'ambiente lucale vicinu à u QB.
Ancu s'è l'apolipoproteina (senza chinone QB) è a struttura cumpleta rapprisentanu solu duie istantanee di u turnover di u situ QB, invece di una seria d'eventi, ci sò indicazioni chì u ligame pò esse interrottu per impedisce u rilegamentu da l'idrochinone per inibisce l'inibizione di u substratu. L'interazzione di chinololu è chinone vicinu à u situ QB di l'apolipoproteina pò esse diversa, ciò chì porta à u so rigettu da RC. Hè statu longu prupostu chì i cambiamenti cunfurmazionali ghjocanu un rolu in u ligame è a riduzione di i chinoni. A capacità di i RC congelati di riduce i chinoni dopu l'adattazione à u bughju hè compromessa (36); A cristallografia à raggi X mostra chì questu dannu hè duvutu à u fattu chì i chinoni QB sò intrappulati in una cunfurmazione "distale" à circa 4,5 Å da a pusizione prossimale attiva (26), 37). Suggeremu chì sta cunfurmazione di ligame distale hè un'istantanea di u statu intermediu trà l'apolipoproteina è a struttura di l'anellu cumpletu, chì seguita l'interazzione iniziale cù u chinone è l'apertura di u situ QB.
U RC di tipu II truvatu in u cumplessu PSII di certi batteri fototrofi è cianobatteri, alghe è piante hà una cunservazione strutturale è funzionale (38). L'allineamentu strutturale mostratu in a Figura 6 (D è E) mette in risaltu a similitudine trà i RC PSII è u situ QB di u cumplessu RC battericu. Questa paragone hè stata dapoi longu un mudellu per studià i sistemi strettamente correlati di ligame è riduzione di chinone. Pubblicazioni precedenti anu suggeritu chì i cambiamenti cunfurmazionali sò accumpagnati da a riduzione PSII di chinoni (39, 40). Dunque, cunsiderendu a cunservazione evolutiva di RC, questu mecanismu di ligame prima micca osservatu pò ancu esse applicabile à u situ QB di PSII RC in piante fototrofe ossigenate.
I ceppi Rps ΔpufW (delezione di pufW senza marcatura) è PufW-His (proteina-W marcata cù 10x His à u C-terminale espressa da u locus naturale di pufW). palustris CGA009 hè statu discrittu in u nostru travagliu precedente (16). Quessi ceppi è u genitore isogenicu di tipu salvaticu sò stati recuperati da u congelatore striscendu un picculu numeru di cellule nantu à una piastra PYE (ognuna 5 g litru -1) (cunservata in LB à -80 °C, chì cuntene 50% (p/v) di glicerolu) di proteine, estrattu di levitu è ​​succinatu) agar [1,5% (p/v)]. A piastra hè stata incubata durante a notte à u bughju à temperatura ambiente in cundizioni anaerobiche, è dopu illuminata cù luce bianca (~50 μmolm-2 s-1) furnita da lampadine alogene OSRAM 116-W (RS Components, UK) per 3 à 5 ghjorni finu à chì una sola culunia hè apparsa. Una sola culunia hè stata aduprata per inoculà 10 ml di mezu M22+ (41) supplementatu cù 0,1% (p/v) di casaminoacidi (in seguitu chjamatu M22). A cultura hè stata cultivata in cundizioni di bassu ossigenu à u bughju à 34°C cù agitazione à 180 rpm per 48 ore, è dopu 70 ml di a cultura hè stata inoculata in e stesse cundizioni per 24 ore. Una cultura semi-aerobica cù un vulume di 1 ml hè aduprata per inoculà 30 ml di mezu M22 in una buttiglia di vetru trasparente cù tappu à vite universale di 30 ml è irradiata cù agitazione (~50μmolm-2 s-1) per 48 ore per mezu di una asta di agitazione magnetica sterile. Dopu 30 ml di a cultura hè stata inoculata cù circa 1 litru di cultura in e stesse cundizioni, chì hè stata poi aduprata per inoculà circa 9 litri di cultura illuminata à ~200 μmolm-2 s-1 per 72 ore. E cellule sò state raccolte per centrifugazione à 7132 RCF per 30 minuti, risospese in ~10 ml di 20 mM tris-HCl (pH 8,0) è conservate à -20 °C finu à u mumentu di u bisognu.
Dopu a scongelazione, aghjunghjite qualchi cristalli di desossiribonucleasi I (Merck, UK), lisozima (Merck, UK) è duie pasticche d'inibitore di proteasi di l'oloenzima Roche (Merck, UK) à e cellule risospese. In una cella di pressione francese di 20.000 psi (Aminco, USA), e cellule sò state disgregate da 8 à 12 volte. Dopu avè eliminatu e cellule intatte è i detriti insolubili per centrifugazione à 18.500 RCF per 15 minuti à 4 °C, a membrana hè stata precipitata da u lisatu pigmentatu per centrifugazione à 113.000 RCF per 2 ore à 43.000 °C. Scartate a frazione solubile è risospendete a membrana culurata in 100 à 200 ml di tris-HCl 20 mM (pH 8,0) è omogeneizate finu à chì ùn ci sò più aggregati visibili. A membrana suspesa hè stata incubata in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) chì cuntene 2% (p/v) β-DDM per 1 ora à u bughju à 4°C cù una delicata agitazione. Dopu, centrifugà à 70°C per scioglie 150.000 RCF à 4°C per 1 ora per eliminà l'insolubili residui.
A membrana solubilizante di a ceppa ΔpufW hè stata applicata à una colonna di scambiu ionicu DEAE Sepharose di 50 ml cù trè volumi di colonna (CV) di buffer di legame [20 mM tris-HCl (pH 8.0) chì cuntene 0.03% (w/v) β-DDM]. Lavà a colonna cù dui buffer di legame CV, è dopu lavà a colonna cù dui buffer di legame chì cuntenenu 50 mM NaCl. U cumplessu RC-LH116 hè statu eluitu cù un gradiente lineare da 150 à 300 mM NaCl (in buffer di legame) nantu à 1.75 CV, è u cumplessu di legame restante hè statu eluitu cù un buffer di legame chì cuntene 300 mM NaCl nantu à 0.5 CV. Raccoglie u spettru d'assorbimentu trà 250 è 1000 nm, mantene a frazione cù un rapportu d'assorbanza (A880/A280) superiore à 1 à 880 à 280 nm, diluisce duie volte in u buffer di legame, è aduprate a stessa prucedura di novu nantu à a colonna DEAE durante a purificazione. Diluite e frazioni cù rapporti A880/A280 superiori à 1,7 è rapporti A880/A805 superiori à 3,0, eseguite u terzu ciclu di scambiu ionicu, è cunservate e frazioni cù rapporti A880/A280 superiori à 2,2 è rapporti A880/A805 superiori à 5,0. U cumplessu parzialmente purificatu hè statu cuncintratu à ~2 ml in un filtru centrifugu Amicon 100.000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, UK), è caricatu nantu à una colonna di esclusione di dimensione Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) chì cuntene 200 mM di buffer NaCl, è dopu eluitu in u listessu buffer à 1,5 CV. Raccoglie i spettri di assorbimentu di a frazione di esclusione di dimensione, è cuncintrate i spettri di assorbimentu cù rapporti A880/A280 sopra 2,4 è rapporti A880/A805 sopra 5,8 à 100 A880, è aduprateli immediatamente per a preparazione o a conservazione di a griglia cryo-TEM. Mantene à -80 °C finu à quandu hè necessariu.
A membrana solubilizante di a ceppa PufW-His hè stata applicata à una colonna HisPrep FF Ni-NTA Sepharose di 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) chì cuntene 200 mM NaCl è 0.03% (p/p)) in buffer IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. A colonna hè stata lavata cù cinque CV di buffer IMAC, è dopu cù cinque CV di buffer IMAC chì cuntene 10 mM d'istidina. U cumplessu centrale hè statu eluitu da a colonna cù cinque buffer IMAC chì cuntenenu 100 mM d'istidina. A frazione chì cuntene u cumplessu RC-LH114-W hè cuncentrata à ~10 ml in un tank agitatu equipatu cù un filtru Amicon 100.000 MWCO (Merck, UK), diluita 20 volte cù buffer di legame, è dopu aghjunta à 25 ml. In a colonna DEAE Sepharose, quattru CV ligati à u buffer sò aduprati in anticipu. Lavà a colonna cù quattru buffer di ligame CV, poi eluì u cumplessu nantu à ottu CV nantu à un gradiente lineare da 0 à 100 mM NaCl (in buffer di ligame), è i quattru CV rimanenti chì cuntenenu 100 mM di buffer di ligame. I cumplessi residuali eluiti nantu à u cloruru di sodiu cumminatu cù u rapportu A880/A280 superiore à 2,4 è u rapportu A880/A805 superiore à 4,6. E frazioni sò state cuncintrate à ~2 ml in un filtru centrifugu Amicon 100.000 MWCO, è riempite cù 1,5 CV IMAC in anticipu. Superdex 200 16/600 equilibratu cù un buffer. Colonna di esclusione di dimensione Superdex 200 equilibrata in anticipu cù un buffer, è poi eluì in u listessu buffer sopra 1,5 CV. Raccoglie i spettri d'assorbimentu di e frazioni di esclusione di dimensione è cuncentrate i spettri d'assorbimentu cù rapporti A880/A280 superiori à 2,1 è rapporti A880/A805 superiori à 4,6 à 100 A880, chì sò immediatamente aduprati per a preparazione di a griglia TEM congelata o conservati à -80°C finu à quandu sò necessarii.
Un congelatore à immersione Leica EM GP hè statu utilizatu per preparà griglie TEM à bassa temperatura. U cumplessu hè statu diluitu in buffer IMAC à A880 di 50, è dopu 5 μl sò stati caricati nantu à una maglia di rame rivestita di carbone QUANTIFOIL 1.2/1.3 appena scaricata à bagliore (Agar Scientific, UK). Incubate a griglia à 20 °C è 60% di umidità relativa per 30 s, poi asciugatela per 3 s, è poi raffreddatela in etano liquidu à -176 °C.
I dati di u cumplessu RC-LH114-W sò stati arregistrati nant'à l'eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) cù un microscopiu Titan Krios, chì funziona à una tensione d'accelerazione di 300 kV, cù un ingrandimentu nominale di 130.000 × è una energia di - Sceglite un gap di 20 eV. Un Gatan 968 GIF Quantum cù un detector di piccu K2 hè statu utilizatu per arregistrà l'imagine in modu di contu per raccoglie dati. A dimensione di u pixel calibratu hè 1,048 Å, è a tarifa di dose hè 3,83 e-Å-2s-1. U filmu hè statu raccoltu in 11 secondi è divisu in 40 parti. Aduprate l'area rivestita di carbone per rifocalizà u microscopiu, è dopu raccoglie trè filmi per foru. In totale, sò stati raccolti 3130 filmi, cù valori di sfocatu trà -1 è -3 μm.
I dati per u cumplessu RC-LH116 sò stati raccolti cù u listessu microscopiu à u Laboratoriu di Biostruttura Asterbury (Università di Leeds, Regnu Unitu). I dati sò stati raccolti in modu di contu cù un ingrandimentu di 130 k, è a dimensione di i pixel hè stata calibrata à 1,065 Å cù una dosa di 4,6 e-Å-2s-1. U filmu hè statu registratu in 12 secondi è divisu in 48 parti. In tutale, sò stati raccolti 3359 filmi, cù valori di sfocatu trà -1 è -3 μm.
Tuttu u trattamentu di i dati hè realizatu in u pipeline Relion 3.0 (42). Aduprate Motioncorr 2 (43) per curregge u muvimentu di u fasciu per ponderazione di a dosa, è dopu aduprate CTFFIND 4.1 (44) per determinà u parametru CTF (funzione di trasferimentu di cuntrastu). E fotomicrografie tipiche dopu queste fasi di trattamentu iniziali sò mostrate in a Figura 2. S16. U mudellu di selezzione automatica hè generatu selezziunendu manualmente circa 250 pixel di 1000 particelle in un quadru di 250 pixel è senza classificazione bidimensionale (2D) di riferimentu, rigettendu cusì quelle classificazioni chì rispondenu à a contaminazione di u campione o ùn anu micca caratteristiche discernibili. Dopu, a selezzione automatica hè stata realizata nantu à tutte e microfotografie, è u RC-LH114-W era 849.359 particelle, è u cumplessu RC-LH116 era 476.547 particelle. Tutte e particelle selezziunate sò state sottumesse à dui cicli di classificazione 2D senza riferimentu, è dopu ogni esecuzione, e particelle chì scontranu l'area di carbone, a contaminazione di u campione, senza caratteristiche evidenti o particelle fortemente sovrapposte sò rigettate, risultendu in 772.033 (90,9%) è 359.678 (75,5%)) E particelle sò aduprate per a classificazione 3D di RC-LH114-W è RC-LH116 rispettivamente. U mudellu di riferimentu 3D iniziale hè statu generatu aduprendu u metudu di discesa di gradiente stocastico. Aduprendu u mudellu iniziale cum'è riferimentu, e particelle selezziunate sò classificate in quattru categurie in 3D. Aduprendu u mudellu in questa categuria cum'è riferimentu, eseguite a raffinazione 3D nantu à e particelle in a categuria più grande, poi aduprate u filtru passa-bassu iniziale di 15 Å per copre l'area di u solvente, aghjunghjite 6 pixel di bordi morbidi è post-processate i pixel per curregge a funzione di trasferimentu di Modulazione di piccu Gatan K2 di u detector superiore. Per u dataset RC-LH114-W, stu mudellu iniziale hè statu mudificatu eliminendu a forte densità à i bordi di a maschera (disconnessa da a densità cumplessa di u core in UCSF Chimera). I mudelli risultanti (e risoluzioni di RC-LH114-W è RC-LH116 sò 3,91 è 4,16 Å, rispettivamente) sò aduprati cum'è riferimentu per u secondu giru di classificazione 3D. E particelle aduprate sò raggruppate in a classa 3D iniziale è ùn cuntenenu micca una forte currelazione cù u vicinariu. Sovrapposizione o mancanza di caratteristiche strutturali evidenti. Dopu u secondu giru di classificazione 3D, a categuria cù a più alta risoluzione hè stata selezziunata [Per RC-LH114-W, una categuria hè 377.703 particelle (44,5%), per RC-LH116, ci sò duie categurie, per un totale di 260.752 particelle (54,7%), induve sò listesse solu quandu sò allineate dopu a rotazione iniziale cù una piccula differenza]. E particelle selezziunate sò riestrattae in una scatula di 400 pixel è raffinate da raffinamentu 3D. A maschera di solvente hè generata aduprendu u filtru passa-bassu iniziale di 15 Å, l'espansione di a mappa di 3 pixel è a maschera dolce di 3 pixel. Aduprendu u raffinamentu CTF per particella, a currezzione di u muvimentu per particella è u secondu ciclu di raffinamentu CTF per particella, u raffinamentu 3D, u mascheramentu di solvente è u post-elaborazione sò realizati dopu ogni passu per raffinà ulteriormente a struttura risultante. Aduprendu u valore limite FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) di 0,143, e risoluzioni di i mudelli finali di RC-LH114-W è RC-LH116 sò 2,65 è 2,80 Å, rispettivamente. A curva FSC di u mudellu finale hè mostrata in a Figura 2. S17.
Tutte e sequenze di proteine ​​sò telecaricate da UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) hè statu utilizatu per custruisce un mudellu d'omologia di RC, chì cuntene e sequenze di proteine ​​di RC-L, RC-M è RC-H è a struttura cristallina di Rba. sphaeroides RC hè statu utilizatu cum'è mudellu (PDB ID: 5LSE) (46). Aduprate u strumentu "fit map" in UCSF Chimera per adattà u mudellu generatu à a mappa (47), migliurà a struttura di a proteina, è u cofattore [4×BChl a (nome di residu di a biblioteca di monomeri = BCL), 2×BPh a (BPH), unu o dui tipi di UQ10 (U10), un ferru non eme (Fe) è una 3,4-diidroesacarbonilcolina (QAK)] aduprate Coot (48) per aghjunghje. Siccomu QAK ùn hè micca dispunibule in a biblioteca di monomeri, hè statu parametrizatu aduprendu u strumentu eLBOW in PHENIX (49).
Dopu, a subunità LH1 hè stata custruita. Inizialmente, u strumentu di custruzzione automatica in PHENIX (49) hè statu utilizatu per custruisce automaticamente una parte di a sequenza LH1 utilizendu a mappa è e sequenze di proteine ​​LH1-α è LH1-β cum'è input. Selezziunate a subunità LH1 più cumpleta, estraetela è caricatela in Coot, aghjunghjite manualmente a sequenza mancante in ella, è raffinate manualmente tutta a struttura prima di aghjunghje dui BCl a (BCL) è una spirilloxantina (CRT) [secondu e Rps pertinenti. A densità di u cumplessu LH1 è u cuntenutu di carotenoidi cunnisciutu. Spezie (17)]. Cupiate a subunità LH1 cumpleta, è aduprate u "Docking Map Tool" di UCSF Chimera per attraccà in l'area adiacente non mudellu di densità LH1, è poi raffinatela in Coot; ripetite u prucessu finu à chì tutte e subunità LH1 sò state modellate. Per a struttura RC-LH114-W, estraendu a densità micca allocata in Coot, a proteina hè segmentata da i cumpunenti non proteichi rimanenti in a mappa USCF Chimera è u strumentu Autobuild hè utilizatu per stabilisce u mudellu iniziale, è a Modellazione di e subunità rimanenti (proteina-W). In PHENIX (49). Aghjunghjite qualsiasi sequenza mancante à u mudellu risultante in Coot (48), è dopu raffinate manualmente tutta a subunità. A densità micca allocata rimanente si adatta à a cumbinazione di lipidi (ID di a biblioteca di monomeri PDB di CDL = CDL, POPC = 6PL è POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) è molecule UQ10 (U10). Aduprate l'ottimisazione PHENIX (49) è l'ottimisazione manuale in Coot (48) per perfezziunà u mudellu iniziale cumpletu finu à chì e statistiche di u mudellu è a qualità visuale di l'adattamentu ùn ponu esse ulteriormente migliurate. Infine, aduprate LocScale (50) per affinà a mappa lucale, è dopu eseguite parechji altri cicli di modellazione di a densità micca allocata è l'ottimisazione automatica è manuale.
I rispettivi peptidi, cofattori è altri lipidi è chinoni agganciati in e so rispettive densità sò mostrati in e Figure 1 è 2. S18 à S23. L'infurmazioni statistiche di u mudellu finale sò mostrate in a Tavula S1.
Salvu specificazione contraria, i spettri d'assorbimentu UV/Vis/NIR sò stati raccolti nantu à un spettrofotometru Cary60 (Agilent, USA) à intervalli di 1 nm da 250 nm à 1000 nm è un tempu d'integrazione di 0,1 s.
Diluite u campione in una cuvetta di quarzu cù un percorsu di 2 mm finu à A880 di 1, è raccogliete u spettru d'assorbimentu trà 400 è 1000 nm. I spettri dicroici circulari sò stati raccolti nantu à un spettropolarimetru Jasco 810 (Jasco, Giappone) à intervalli di 1 nm trà 400 nm è 950 nm à una velocità di scansione di 20 nm min-1.
U cuefficiente d'estinzione molare hè determinatu diluendu u cumplessu core à un A880 di circa 50. Diluite u vulume di 10 μl in 990 μl di buffer di legame o metanolu, è raccogliete subitu u spettru d'assorbimentu per minimizà a degradazione di BChl. U cuntenutu di BChl di ogni campione di metanolu hè statu calculatu da u cuefficiente d'estinzione à 771 nm di 54,8 mM-1 cm-1, è u cuefficiente d'estinzione hè statu determinatu (51). Divide a cuncentrazione di BChl misurata per 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) per determinà a cuncentrazione di u cumplessu core, chì hè poi aduprata per determinà u spettru d'assorbimentu di u listessu campione raccoltu in u buffer di cuefficiente d'estinzione parallelu. Trè misurazioni ripetute sò state prese per ogni campione, è l'assorbanza media di u massimu Qy di BChl hè stata aduprata per u calculu. U coefficientu d'estinzione di RC-LH114-W misuratu à 878 nm hè 3280 ± 140 mM-1 cm-1, mentre chì u coefficientu d'estinzione di RC-LH116 misuratu à 880 nm hè 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
UQ10 hè statu quantificatu secondu u metudu in (52). In breve, l'HPLC in fase inversa (RP-HPLC) hè stata realizata utilizendu u sistema Agilent 1200 HPLC. Dissolvite circa 0,02 nmol di RC-LH116 o RC-LH114-W in 50 μl di 50:50 metanolu:cloroformiu chì cuntene 0,02% (w/v) di cloruru ferricu, è iniettate l'Ultrasfera ODS 4,6 mm di Beckman Coulter preequilibrata Dissolvite in 1 ml-1 min-1 à 40 °C in solvente HPLC (80:20 metanolu:2-propanolu) nantu à una colonna di ×25 cm. Eseguite l'eluzione isocratica in un solvente HPLC per monitorà l'assorbanza à 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoidi) è 780 nm (BChl) per 1 ora. U piccu in u cromatogramma di 275 nm à 25,5 minuti hè statu integratu, chì ùn cuntene micca altri cumposti rilevabili. L'area integrata hè aduprata per calculà a quantità molare di UQ10 estratta cù riferimentu à a curva di calibrazione calculata da l'iniezione di standard puri da 0 à 5,8 nmol (Figura S14). Ogni campione hè statu analizatu in trè repliche, è l'errore riportatu currisponde à a SD di a media.
Una suluzione chì cuntene u cumplessu RC-LH1 cù un assorbimentu Qy massimu di 0,1 hè stata preparata cù 30 μM di citocromu c2 di core di cavallu riduttu (Merck, UK) è da 0 à 50 μMUQ2 (Merck, UK). Trè campioni di 1 ml sò stati preparati à ogni cuncentrazione di UQ2 è incubati durante a notte à u bughju à 4 ° C per assicurà un adattamentu cumpletu à u bughju prima di a misurazione. A suluzione hè stata caricata in un spettrofotometru mudulare OLIS RSM1000 equipatu cù una fiamma di 300 nm / reticolo di 500 linee, entrata di 1,24 mm, fessure centrali di 0,12 mm è uscita di 0,6 mm. Un filtru passa-lungu di 600 nm hè piazzatu à l'entrata di u fototubu di campione è di u tubu fotomoltiplicatore di riferimentu per escludere a luce di eccitazione. L'assorbanza hè stata monitorata à 550 nm cù un tempu d'integrazione di 0,15 s. A luce d'eccitazione hè emessa da u LED (diodu emettitore di luce) M880F2 di 880 nm (Thorlabs Ltd., UK) attraversu un cavu in fibra ottica à 90% d'intensità attraversu un controller DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) è hè emessa à a fonte luminosa à un angulu di 90°. U fasciu di misurazione hè oppostu à u specchiu per restituisce qualsiasi luce chì ùn hè stata inizialmente assorbita da u campione. Monitorate l'assorbanza 10 s prima di l'illuminanza di 50 s. Dopu, l'assorbanza hè stata ulteriormente monitorata per 60 s à u bughju per valutà a misura in cui u chinololu riduce spontaneamente u citocromu c23+ (vede a Figura S8 per i dati grezzi).
I dati sò stati trattati adattendu una velocità iniziale lineare in 0,5 à 10 s (secondu a cuncentrazione di UQ2) è calculendu a media di e velocità di tutti i trè campioni à ogni cuncentrazione di UQ2. A cuncentrazione di RC-LH1 calculata da u rispettivu coefficientu di estinzione hè stata aduprata per cunvertisce a velocità in efficienza catalitica, tracciata in Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), è adattata à u mudellu Michaelis-Menten per determinà i valori apparenti di Km è Kcat.
Per e misurazioni di l'assorbimentu transitoriu, u campione RC-LH1 hè statu diluitu à ~2μM in un buffer IMAC chì cuntene 50 mM di ascorbatu di sodiu (Merck, USA) è 0,4 mM di Terbutina (Merck, USA). L'acidu ascorbicu hè adupratu cum'è donatore di elettroni sacrificali, è u tert-butaclofen hè adupratu cum'è inibitore QB per assicurà chì u principale donatore RC resti riduttu (vale à dì, micca fotoossidatu) durante tuttu u prucessu di misurazione. Circa 3 ml di campione sò aghjunti à una cellula rotante persunalizata (circa 0,1 m di diametru, 350 RPM) cù una lunghezza di u percorsu otticu di 2 mm per assicurà chì u campione in u percorsu laser abbia abbastanza tempu per l'adattazione à u bughju trà l'impulsi di eccitazione. Aduprate impulsi laser di ~100 fs per amplificà u sistema laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) per eccità u campione à 880 nm à una frequenza di ripetizione di 1 kHz (20 nJ per NIR o 100 nJ per Vis). Prima di raccoglie dati, espone u campione à a luce d'eccitazione per circa 30 minuti. L'esposizione pruvucarà l'inattivazione di QA (pussibbilmente riducendu QA una o duie volte). Ma tenete à mente chì stu prucessu hè reversibile perchè dopu un longu periodu d'adattazione à u bughju, RC tornerà pianu pianu à l'attività QA. Un spettrometru Helios (Ultrafast Systems, USA) hè statu utilizatu per misurà i spettri transitori cù un tempu di ritardu da -10 à 7000 ps. Aduprate u software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) per sgruppà i gruppi di dati, poi fusionalli è standardizalli. Aduprate u pacchettu software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) per aduprà u gruppu di dati cumminatu per ottene spettri differenziali relativi à u decadimentu, o aduprate una funzione chì cunvolve più esponenti cù a risposta di u strumentu per adattà l'evoluzione spettrale à lunghezza d'onda unica in Origin (OriginLab, USA).
Cum'è mintuvatu sopra (53), hè stata preparata una pellicola fotosintetica chì cuntene u cumplessu LH1 chì ùn hà micca l'antenna RC è l'antenna LH2 periferica. A membrana hè stata diluita in 20 mM tris (pH 8.0) è dopu caricata in una cuvetta di quarzu cù un percorsu otticu di 2 mm. Un impulsu laser di 30nJ hè statu utilizatu per eccità u campione à 540 nm cù un tempu di ritardu da -10 à 7000 ps. Processate u set di dati cum'è descrittu per u campione Rps.pal.
A membrana hè stata pellettata per centrifugazione à 150.000 RCF per 2 ore à 4°C, è dopu a so assorbanza à 880 nm hè stata risospesa in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) è 200 mM NaCl. Dissolve a membrana mesculendu lentamente in 2% (p/v) β-DDM per 1 ora à u bughju à 4°C. U campione hè statu diluitu in 100 mM di carbonatu di trietilammoniu (pH 8,0) (TEAB; Merck, UK) à una cuncentrazione di proteine ​​di 2,5 mg ml-1 (analisi Bio-Rad). Un ulteriore trattamentu hè statu realizatu da u metudu publicatu prima (54), cuminciendu cù a diluzione di 50 μg di proteine ​​in un totale di 50 μl di TEAB chì cuntene 1% (p/v) di lauratu di sodiu (Merck, UK). Dopu à a sonicazione per 60 s, hè stata ridutta cù 5 mM di tris(2-carboxietil)fosfina (Merck, UK) à 37°C per 30 minuti. Per a S-alchilazione, incubate u campione cù 10 mM di metil S-metiltiometansolfonatu (Merck, UK) è aghjunghjitelu da una soluzione madre di isopropanolo 200 mM per 10 minuti à temperatura ambiente. A digestione proteolitica hè stata effettuata aghjunghjendu 2 μg di mistura di tripsina/endoproteinasi Lys-C (Promega UK) è incubata à 37°C per 3 ore. U tensioattivu lauratu hè statu estrattu aghjunghjendu 50 μl di acetatu d'etile è 10 μl di acidu trifluoroaceticu di qualità LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) à 10% (v/v) è vortexendu per 60 s. A separazione di fase hè stata prumossa da centrifugazione à 15.700 RCF per 5 minuti. Sicondu u protocolu di u fabricatore, una colonna di spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) hè stata aduprata per aspirà è dissalà cù cura a fase inferiore chì cuntene u peptide. Dopu l'asciugatura per centrifugazione à vuoto, u campione hè statu dissoltu in 0,5% TFA è 3% acetonitrile, è 500 ng sò stati analizati per cromatografia RP à nanoflussu accoppiata à spettrometria di massa utilizendu i parametri di sistema dettagliati prima.
Aduprate MaxQuant v.1.5.3.30 (56) per l'identificazione è a quantificazione di e proteine ​​per circà a basa di dati di u proteoma Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). I dati di a proteomica di a spettrometria di massa sò stati depositati in a ProteomeXchange Alliance per mezu di u repositoriu di i partenarii PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sottu l'identificatore di u dataset PXD020402.
Per l'analisi per RPLC accoppiata cù a spettrometria di massa di ionizazione elettrospray, u cumplessu RC-LH1 hè statu preparatu da Rps di tipu salvaticu. Usendu u metudu publicatu prima (16), a cuncentrazione di proteine ​​prodotta in e cellule palustris era di 2 mg ml-1 in 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl è 0,03% (w/v) β- (analisi Bio-Rad)) DDM. Sicondu u protocolu di u fabricatore, aduprate un kit di purificazione 2D (GE Healthcare, USA) per estrarre 10 μg di proteine ​​per metudu di precipitazione, è scioglie u precipitatu in 20 μl 60% (v/v) acidu formicu (FA), 20% (v/v) Acetonitrile è 20% (v/v) acqua. Cinque microlitri sò stati analizati per RPLC (Dionex RSLC) accoppiatu cù a spettrometria di massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Aduprate a colonna MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) per a separazione à 60°C è 100μlmin -1, cù un gradiente di 85% (v/v) di solvente A [0.1% (v/v) FA è 0.02% (V/v) soluzione acquosa di TFA] à 85% (v/v) di solvente B [0.1% (v/v) FA è 0.02% (v/v) in 90% (v/v) acetonitrile TFA]. Aduprendu una fonte di ionizazione elettrospray standard è parametri predefiniti per più di 60 minuti, u spettrometru di massa ottiene da 100 à 2750 m/z (rapportu massa-carica). Cù l'aiutu di u strumentu FindPept di u portale di risorse bioinformatiche ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mappate u spettru di massa à e subunità di u cumplessu.
E cellule sò state cultivate per 72 ore sottu à 100 ml di luce NF-bassa (10μMm-2 s-1), media (30μMm-2 s-1) o alta (300μMm-2 s-1). Mezzu M22 (mezzu M22 in u quale u sulfatu d'ammoniu hè omessu è u succinatu di sodiu hè rimpiazzatu da acetatu di sodiu) in una buttiglia cù tappu à vite da 100 ml (23). In cinque cicli di 30 secondi, perle di vetru di 0,1 micron sò state perlate à un rapportu di vulume di 1:1 per lisà e cellule è raffreddate nantu à u ghjacciu per 5 minuti. A materia insolubile, e cellule intatte è e perle di vetru sò state eliminate per centrifugazione à 16.000 RCF per 10 minuti in una microcentrifuga da banco. A membrana hè stata separata in un rotore Ti 70.1 cù 100.000 RCF in 20 mM tris-HCl (pH 8.0) cù un gradiente di saccarosu 40/15% (p/p) per 10 ore.
Cum'è discrittu in u nostru travagliu precedente, immunodetezione di u tag His nantu à PufW (16). In breve, u cumplessu core purificatu (11,8 nM) o a membrana chì cuntene a listessa cuncentrazione di RC (determinata da l'ossidazione sottraendu u spettru di differenza ridutta è currispundendu à carica nantu à u gel culuritu) in buffer di carica 2x SDS (Merck, UK) diluitu duie volte. E proteine ​​sò state separate nantu à una replica di gel NuPage bis-tris 12% (Thermo Fisher Scientific, UK). Un gel hè statu culuritu cù Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) per caricà è visualizà a subunità RC-L. A proteina nantu à u secondu gel hè stata trasferita à a membrana di fluoruru di polivinilidene attivatu da metanolu (Thermo Fisher Scientific, UK) per l'immunodosaggio. A membrana PVDF hè stata bluccata in 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 è 5% (w/v) latte scrematu in polvere, è dopu incubata cù l'anticorpu primariu anti-His (in diluitu u buffer di l'anticorpu [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl è 0,05% (v/v) Tween-20] in 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) per 4 ore. Dopu avè lavatu 3 volte per 5 minuti in tampone anticorpi, a membrana hè stata cumminata cù l'anticorpu secundariu anti-topo di perossidasi di rafano (Sigma-Aldrich, UK) (diluitu 1:10.000 in tampone anticorpi). Incubà per permette a rilevazione (5 minuti dopu à 3 lavaggi in tampone anticorpi) utilizendu u substratu di chemiluminescenza WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italia) è Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Tracciendu a distribuzione di l'intensità di ogni gel culuritu o corsia di immunodosaggio, integrandu l'area sottu à u piccu è calculendu u rapportu di intensità di RC-L (gel culuritu) è Protein-W (immunodosaggio), in ImageJ (57) Processate l'immagine. Questi rapporti sò stati cunvertiti in rapporti molari assumendu chì u rapportu di RC-L à proteina-W in u campione puru RC-LH114-W era 1:1 è nurmalizendu tuttu u set di dati in cunsequenza.
Per materiali supplementari per questu articulu, per piacè vede http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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